【目的】研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞CyclinE基因表达及细胞周期的影响。【方法】合成针对CyclinE基因1 252和568位点的siRNA片段,并利用脂质体法转染家蚕BmN细胞,于共聚焦荧光显微镜下观察转染情况;应用实时荧光定量PCR法检测CyclinE mRNA的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】siRNA对家蚕BmN细胞的转染效率达80%左右。转染1252-siRNA-CyclinE和568-siRNA-CyclinE 48h后,分别使家蚕BmN细胞CyclinE mRNA表达量降低了68%和90%;...

[目的]研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(Bm N)细胞cyclin A基因表达及细胞周期的影响。[方法]通过脂质体转染试剂将针对cyclin A基因的特异性siRNA片段转入家蚕Bm N细胞,采用SYBR荧光定量PCR法检测cyclin A mRNA的表达,流式细胞技术检测细胞周期变化。[结果]转染siRNA-cyclin A可有效下调cyclin A基因的表达,转染48 h后,cyclin A mRNA表达量降低到对照的37.4%;流式细胞仪分析表明:与对照组相比,转染组G0/G1期细胞比例显著增加,细胞周期阻滞于G1期。[结论]靶...

[目的]研究小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）对家蚕卵巢细胞系（BmN）细胞 cyclinA基因表达及细胞周期的影响。[方法] 通过脂质体转染试剂将针对 cyclinA 基因的特异性 siRNA 片段转入家蚕 BmN 细胞，采用 SYBR 荧光定量 PCR 法检测 cyclinA mRNA 的表达，流式细胞技术检测细胞周期变化。[结果]转染 siRNA-cyclinA 可有效下调 cyclinA 基因的表达，转染 48 h 后，cyclinA mRNA 表达量降低到对照的 37.4%；流式细胞仪分析表明，与对照组相比，转染组 G0/G1期细胞比率显著增加，...

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P

【目的】细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP)的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。【方法】利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。【结果】通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。【结论】鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。

【目的】探讨经辛硫磷诱导后,家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在5龄幼虫各种组织中的转录活性,为进一步研究有机磷农药对家蚕的损伤机制提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,以饲喂清水浸泡过的桑叶为对照,分析家蚕5龄3d幼虫喂食辛硫磷(4μg/mL)浸泡桑叶24h后,脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢及卵巢等7种组织中4种细胞周期蛋白家族基因的转录水平。【结果】与对照组相比,辛硫磷诱导24h后,CyclinA、CyclinB、CyclinB3在各组织中均表达上调,CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,在精巢与马氏管中无明显变...

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别...

【目的】克隆家蚕整合素基因BmintegrinαPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究BmintegrinαPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmintegrinαPS3的cDNA全长序列;采用RT-PCR方法检测BmintegrinαPS3的时空表达;在原核表达系统中表达获得BmintegrinαPS3重组蛋白;并构建BmintegrinαPS3真核表达载体,转染家蚕胚胎细胞系分析其蛋白亚细胞定位。【结果】家蚕整合素基因BmintegrinαPS3编码框全长为2 895 bp,编码965个氨基酸,含有整合素家族蛋白典型的...

【目的】探讨家蚕NF-κB类转录因子Bm Relish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当Bm NPV感染家蚕Bm E细胞后Bm Relish全长形式(Bm Relish-FL)是否转变成其活性形式(Bm Relishact);利用荧光定量PCR检测过表达Bm Relishact的细胞在感染Bm NPV后胞内病毒DNA的

【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为:睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细...

以初始体质量(6.02±0.16)g的鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,在鲫鱼基础饲料中分别添加0.0 g/kg、1.0g/kg、2.5 g/kg、5.0 g/kg、7.5 g/kg的包膜丁酸钠,配制5种等氮等能的实验饲料,研究不同浓度包膜丁酸钠通过促进鲫鱼肠细胞增殖对其生长作用的影响。实验在室内养殖系统中进行,每水族缸饲喂30尾,每处理组3个重复,以鱼体质量3%~5%投喂量,日投喂3次,试验持续7周。实验结果表明:在饲料中添加丁酸钠对鲫鱼有明显的促生长作用,显著提高了鲫鱼前肠绒毛高度/隐窝深度的比值以及肠道细胞增殖因子CREB和CDX2基因的表达。当丁酸钠添加量为2.5 ...

【目的】探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物(Trolox)通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础。【方法】首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度(0、50、100和200μmol·L~(-1))的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞计数,统计细胞增殖倍数,同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响;利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的PAX7表达水平,Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平;通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用;进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理,利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因MYOG、CAV-3及终末分化标志基因肌球蛋白重链(MyHC)的表达水平,并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达,利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计MyHC阳性细胞比例。【结果】细胞增殖倍数统计显示,50和100μmol·L~(-1)的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组(P<0.05);100和200μmol·L~(-1)的Trolox显著上调了PAX7的表达(P0.05);添加Trolox后,细胞内活性氧水平被极显著降低(P<0.001);在分化进程中添加Trolox后,预分化阶段的MYOG和CAV-3及终末分化阶段的MyHC均显著上调(P0.05);免疫荧光结果显示MyHC阳性细胞比例有增多的趋势,但无显著差异(P>0.05)。【结论】Trolox通过降低细胞内的活性氧,促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程。

[目的]本试验旨在解决鸡胚盘细胞(c BC)不易贴壁的问题及应用E8培养基建立新的鸡胚盘细胞培养体系。[方法]在E8培养基基础上,应用10 g·L(-1)明胶和人重组玻连蛋白(h VTN)包被培养板,对比其在促进鸡胚盘细胞贴壁速度、促进增殖和维持多功能性方面的差异。[结果]使用10 g·L(-1)明胶包被培养板后,鸡胚盘细胞12 h内即可迅速贴壁。10 g·L(-1)明胶处理组中5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01),并且能够抑制凋亡基因P21、Fas的mRN

【目的】探讨pH改性和热改性甘薯果胶对结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞Bcap-37和肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。【方法】分别对改性前后甘薯果胶的半乳糖醛酸含量、酯化度、分子量、微观结构及癌细胞增殖抑制活性进行测定。【结果】果胶改性后半乳糖醛酸含量显著提高(P<0.05),而酯化度和分子量降低,微观结构发生明显变化。未改性、pH改性和热改性甘薯果胶对3种癌细胞均有抑制作用,并呈浓度和时间依赖性;改性后甘薯果胶对3种癌细胞增殖抑制效果均有显著提高(P<0.05),且改性甘薯果胶对HT-29和Bcap-37的抑制效果更显著。【结论】改性甘薯果胶对HT-29和Bcap-37的增殖抑制效果较...

胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期发育胚胎中分离出来的具有发育全能性的一种未分化细胞系。维持花鲈胚胎干细胞(LJES1)的体外生长、增殖及未分化状态需要在培养基中添加一些生长因子。实验通过配制省略1种或多种因子的培养基PESM0～10,计数LJES1细胞在各培养基中增殖的数量,确定各种生长因子对LJES1细胞的增殖作用。同时,对LIF因子和bFGF因子的作用进行了重点的研究,发现LIF因子对早期的LJES1细胞增殖几乎没有作用,其主要作用是维持LJES1细胞的未分化状态,但对晚期LJES1细胞的增殖有一定的作用;bFGF因子对LJES1细胞有强烈的刺激增殖的作用;鲈鱼胚胎抽提液(PEE)以及鲈...