【目的】构建piggyBac(PB)转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含...

根据鱼类Tc1-like超家族转座子的末端反向重复序列设计单引物,对西藏亚东鲑基因组进行PCR扩增、回收、克隆和测序,鉴定出亚东鲑两条长度为1 607 bp和1 473 bp的Tc1-like超家族转座子序列,命名为Tbt1和Tbt2。序列分析表明,亚东鲑Tbt1转座子左右两端分别存在一个196 nt和225 nt的末端反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITR),在左右ITR中分别包含2个12 nt的亚末端反向重复序列(Subterminal inverted repeats,SIR);亚东鲑Tbt2转座子分别存在一个32 nt和31 nt短的ITR,其左右IT...

【目的】通过分析淅川乌骨鸡全基因组重测序数据,获取淅川乌骨鸡转座子的基本信息和特征分布,探究转座子相关基因参与的通路。不仅对研究淅川乌骨鸡转座子的生物学功能具有重要的意义,而且为探索基因组扩增、基因组功能及进化研究提供重要基础数据。【方法】对淅川乌骨鸡血液DNA进行全基因组重测序,采用双末端短序列比对基因组,运用RepeatModeler、TEclass、RepeatMasker等使用流程对转座子进行鉴定、构建、校正、分类和注释,获得淅川乌骨鸡整个基因组所有的转座子,对转座子的特征、分布及和基因的关系等方面进行分析。并对转座子插入的所有基因进行GO和KEGG数据库富集,分别结合GO和KEGG注释结果对功能进行描述。【结果】经鉴定、分类和注释,淅川乌骨鸡共鉴定到370 252个转座子序列,分为19个超家族,主要为CR1、TcMar-Mariner、ERVL、ERV1等超家族,进一步说明淅川乌骨鸡转座子类型主要是逆转录转座子;转座子的数目和染色体长度有关,染色体越长,转座子数目越多。在基因组中转座子和基因的密度成反比,基因密集的区域中转座子密度较低;基因组内转座子的插入并非随机的,LTR/ERVL、 LTR/ERV1、DNA/PIF-Harbinger、DNA/Hat-Charlie、RC/Helitron等转座子倾向于插入基因外部。GO富集分析表明,在生物过程条目中鉴定出的转座子富集相对较多的是细胞过程、单生物过程、代谢过程、生物调节、刺激反应等;分子功能条目中鉴定出的转座子富集相对较多的是结合、催化活性等;细胞组分条目中鉴定出的转座子富集相对较多的是细胞部分、细胞器、膜等。KEGG富集分析表明,鉴定出的转座子主要在甘油酯代谢、PPAR信号通路、PI3K-Akt信号通路、胰岛素抵抗、Jak-STAT信号通路等通路。着重关注了与淅川乌骨鸡特性相关的通路,如和色素沉积有关的酪氨酸代谢、和肉品质有关的脂代谢、脂肪酸的合成、PI3K-Akt信号通路等。【结论】转座子含量与基因组大小,具有一定的正相关性,而且淅川乌骨鸡转座子在基因组的分布存在一定偏好性。转座子相关基因在色素相关通路中富集,其可能与淅川乌骨鸡的种质特性有关,具体的调控机制还有待进一步研究。

为了探讨Tc1/Mariner转座子在4种鲇(沟鲇、黑斑原、鲇和南方鲇)中的特征及在演化过程中的作用,实验使用de novo预测和同源预测两种方法鉴定了4种鲇基因组中的Tc1/Mariner转座子并进行演化分析。通过对所获得序列的统计及分类,结果显示,4种鲇基因组中Tc1/Mariner转座子的含量分别为9.46%、2.70%、7.83%和8.54%,并且分别被分为38、20、43和55个家族。基于转座酶催化区域的结构和系统发育分析的结果,4种鲇的Tc1/Mariner转座子总共可以分为5个不同的亚类群:DD34E(Tc1)、DD35E、DD36E、DD37E和DD35D(pogo)。系统发育分析表明,多数支系中鲇和南方鲇的转座子聚为姐妹群。插入时间分析表明,Tc1/Mariner转座子的插入时间主要分布在0～5百万年前。大多数Tc1/Mariner转座子在0～1百万年前或2～3百万年前有一个突然的扩增。另外,4种鲇的Tc1/Mariner转座子大部分插入到基因的内含子中。本实验通过对4种鲇中Tc1/Mariner转座子的鉴定、比较与演化分析,为Tc1/Mariner转座子的深入研究奠定了基础。

为了探讨piggyBac转座子在鲤科鱼类及鳅科鱼类转基因中的适用性,实验通过将PAβ启动子控制的DsRed表达元件插入pigA3GFP中,构建转基因载体pigA3GFP-AβDsRed。用该载体对草鱼肾脏(CIK)细胞转染,结果显示,通过piggyBac转座子可将外源基因导入到CIK细胞的基因组中,来源于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的CMV启动子在CIK细胞均具有活性。将转基因载体pigA3GFP、pigA3GFP-AβDsRed分别与辅助质粒helper-pigA3混合后以精子介导法导入金鱼和泥鳅的受精卵后,经荧光观察、PCR鉴定、Dot blotting鉴定,证实获得了转基因金鱼和转...

鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的PiggyBac(PB)转座子已用于模式生物小鼠的转基因及插入诱变研究,目前,该转座子在养殖鱼类中的转基因效率如何还不清楚。构建了带PiggyBac转座子左臂、右臂、EF1α启动子和绿色荧光蛋白(eGFP)编码框的pPBs-EF1α-eGFP供体质粒。以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL体外转录的PB转座酶mRNA共同显微注射入团头鲂(Megalobrama amblycephala)1~2细胞期受精卵中,团头鲂eGFP的荧光表达率可达58.26%,PCR检测结果显示,该转座系统在团头鲂成鱼基因组中的整合效率为53.04%。表明P...

以蒙古冰草DNA为模板,采用PCR扩增的方法从蒙古冰草(Agropyron mongolicumKeng)中分离得到了一个类反转录转座子基因序列,命名为MwRRT(GenBank:GQ855806.1)。序列分析结果表明:该序列长为1 005 bp,包含780 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸。经GenBank中BLAST程序分析表明,该片段98~255处氨基酸与水稻(Oryza sativa)预测逆转录转座子蛋白Ty3-gypsy亚类、预测种属特异抗原—聚合酶(Gag-Pol)前体和预测聚合酶氨基酸同源性为47%;与高粱(Sorghum bicolor)的预测GAG-POL前体氨基酸同源...

在鲤(Cyprinus carpio)基因组中鉴别出一个新的具有潜在转座活性的Tc1类转座子,并命名为CCTN转座子(Cyprinus carpio Transposon,CCTN)。CCTN转座子全长1 611 bp,由两端约214 bp的反向重复序列(Inverted Repeat,IR)和中间不间断的996 bp的转座酶开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)组成。CCTN转座子推测的转座酶序列中存在完整的DD(34)E结构域,此结构域是Tc1类转座酶作用的必需位点之一。采用实时荧光定量PCR评估CCTN转座子在鲤基因组中的拷贝数约为2.28×103,占全基因组的0.2...

【目的】构建在小鼠水平上实现多个目的基因的表达以及标记基因安全删除的转基因载体。【方法】以载体为模板,分别扩增SV40P neo、IRES、tk-PloyA,通过overlap PCR连接,并在两端添加方向相同的LoxP序列,构建转基因基本载体PB-NIT;然后通过overlap PCR扩增获得Tet-CMV-SV40 T-T2A-p 53-PolyA基因表达盒,将其插入PB-NIT中,构建载体PB-NIT-STP;最后将转录因子激活域rtTA通过同尾酶连接插入PB-NIT-STP,构建载体PB-rtTA-NIT-STP。【结果】经酶切和测序等鉴定,以上载体均正确;经转座活性鉴定,共转染转座子...

转座子是动植物基因组的重要组成部分，在前期研究中发现建鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ Ｃａｒｐｉｏ ｖａｒ．ｊｉａｎ）基因组中存在一个ｔｙ３－ｇｙｐｓｙ反转录转座子类型的转座子，并将其命名为ｊｒＥ转座子（ｊｉａｎ Ｃａｒｐ ｒＥｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ，ｊｒＥ）。为了研究ｊｒＥ反转录转座子在建鲤基因组中的功能，采用ｐＣｒ扩增、荧光定量ｐＣｒ和原位杂交等方法对ｊｒＥ转座子的特性进行了研究。ｊｒＥ反转录转座子全长５１２６ ｂｐ，具有５？端４７０ ｂｐ和３？端４５３ ｂｐ长末端重复片段（ｌｏｎｇ ｔＥｒｍｉｎａｌ ｒＥｐＥａｔ Ｅｎｄ，ｌｔｒ），中间的开放阅读框（ｏｒＦ）包括核心蛋白基因（ｇａｇ）和酶基因区．．．

以花叶矢竹Ｐｓｅｕｄｏｓａｓａ ｊａＰｏｎｉｃａ ｆ．ａｋｅｂｏｎｏｓｕｊｉ １０种不同颜色和不同发育阶段的叶片转录组数据为基础，调查了花叶矢竹中转座子的种类、数量以及选择性表达特性。结果表明：花叶矢竹转录组中转座子类型丰富、数量繁多，其中Ｒｎａ转座子明显多于ｄｎａ转座子，转座子ＬＴＲ／ｃｏＰｉａ类型数量最多。绿叶的５个发育阶段中，转座子主要在第５发育阶段高表达，表明这些转座子可能参与了花叶矢竹叶片成熟过程。而在白叶５个发育阶段中，转座子主要在第１发育阶段高表达；对绿叶和白叶５个相对应的发育阶段分析表明，白叶中高表达的转座子多于绿叶，表明这些转座子可能参与了花叶矢竹叶色变异过程，也可能是逆境胁．．．

为探究转座子(Transposable elements, TEs)在谷子、水稻驯化过程中的变异，选取谷子(Setaria italica)、狗尾草(Setaria viridis)、栽培稻(Oryza sativa japonica,Oryza sativa indica)、野生稻(Oryza rufipogon,Oryza nivara)的基因组进行转座子注释，统计分析各类转座子在基因组中的插入数及位置，对调控落粒、分蘖、抽穗期和株高等驯化相关基因进行相似性比对。结果表明：在‘晋谷21’突变体(xiaomi)基因组中插入的转座子数目比狗尾草中多4 865个，‘豫谷1号’基因组中插入的转座子数目比狗尾草中少6 286个，而水稻栽培种基因组中转座子数目及所占比例仅为野生种的1/2。在落粒、米色等驯化相关基因中转座子插入在数目及位置上都存在差异，在谷子落粒基因中，谷子基因存在转座子插入，而狗尾草基因中不存在；在谷子米色相关基因中，狗尾草基因中存在转座子插入，谷子基因中不存在。转座子介导驯化相关基因功能变异，历经较长时间的农业生产将适合栽培的农艺性状稳定了下来。

为了研究内蒙古绒山羊线粒体基因组序列组成及不同品种系统发育关系,明确绒山羊的起源、进化、不同类群的分化以及特定遗传特性形成机制,以内蒙古绒山羊(阿拉善型)为试验研究对象,对其线粒体基因组进行了序列测定和分析。结果表明,测序共得到2 551 175 100 bp碱基数,Q20为95. 40%,文库构建质量好,测序结果准确性高,得到长度为16 642 bp完整的闭合环状线粒体基因组,其GC含量为39. 17%,K-mer为53 bp。从NCBI下载其他绒山羊品种的线粒体基因组序列信息,进行系统发育分析,结果表明,内蒙古绒山羊的3个类群距离比较近,其中,阿拉善型和二狼山型的关系最近,阿尔巴斯次之;内蒙古绒山羊和辽宁绒山羊可以分为单独的2个类群,与国外品种San Clemente的距离最远。

以牡丹基因组为模板,利用简并引物进行PCR扩增,得到了编码Ty1-copia类反转录转座子反转录酶(RT基因)的序列,测序后所得序列长度为240 bp,包含2个开放读码框,共编码63个氨基酸。经NCBI中BLAST比对结果显示,洛阳红牡丹RT基因与枸杞、甜菜等RT基因的同源性均在70%以上。经MEGA和DNAstar软件分析表明,该片段在进化上与梅、杨、茶和苹果等落叶木本植物的同源性序列存在更高的同源性和更近的亲缘关系,与枸杞、鹰嘴豆、番茄、草莓等草本植物的同源性序列亲缘性较远。

综述了基于piggyBac转座子的转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的3个关键环节:(1)外源目的基因高效插入家蚕基因组;(2)转基因家蚕的高效、快捷的检测;(3)具有生物活性的外源目的蛋白的高效表达和纯化。同时介绍了有关转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的研究进展,为更好地利用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白提供了参考。