为了能够快捷地分离纯化出单一的抗菌肽,实验采用不同pH值(离子交换流动相pH3.0、4.0、5.0;反相液相层析流动相pH 2.0、4.5、7.0)缓冲液,不同色谱柱(离子交换和凝胶过滤层析柱分别与反相液相层析柱)联用对日本鳗鲡肝脏抗菌肽分离纯化效果进行了比较,并分析了琼脂板扩散法和微孔液体培养法检测抗菌活性的优缺点。结果显示:pH 4.0缓冲液为最佳离子交换流动相,蛋白提取率为16.43%,得到2个洗脱峰;反相液相层析3种pH缓冲液分离效果均不理想,凝胶过滤层析柱与反相液相层析柱联用能明显改善日本鳗鲡肝脏抗菌肽分离纯化效果,洗脱峰数量较多,峰形单一且尖锐狭窄,基线平而低。琼脂板扩散法检测抗菌...

为分离日本鳗鲡脾脏中的抗菌肽,实验采用10 ku和3 ku切向流中空纤维柱对脾脏醋酸粗提物进行分级分离,并结合阳离子交换层析和反相高效液相层析技术对小于10 ku和小于3 ku 2部分样品分别进行分离纯化。结果显示,2种分子量截留纤维柱超滤获得了大于10 ku、小于10 ku和小于3 ku 3部分样品。小于10 ku和小于3 ku蛋白样品抗菌活性较大于10 ku样品强。对小于10 ku样品经阳离子交换层析以及采用pH 9缓冲液进行反相高效液相层析分离纯化,获得一个抗菌肽,质谱分析其分子量为1 391.82 u;对小于3 ku样品经阳离子交换层析并采用pH 9和pH 2两种缓冲液进行反相高效液相...

对传统抗生素的活性测定方法进行了比较及改进,建立了蛙皮抗菌肽的活性测定方法——TTC微量稀释法;利用SephadexG25凝胶层析分离抗菌肽粗品获得一个活性组分命名为G5,利用TTC微量稀释法测定活性组分G5抑制大肠杆菌的MIC是80μg/mL、抑制铜绿假单胞菌的MIC是20μg/mL、抑制金黄色葡萄球菌的MIC是80μg/mL;活性组分G5再经凝胶HPLC分离纯化获得两个活性组分Ⅰ和Ⅱ,组分Ⅰ和组分Ⅱ再分别经过RP-HPLC分离纯化获得两个色谱纯的活性组分命名为RanaⅠ和RanaⅡ。

以野生家蝇干燥幼虫为原料,在常规的生化提取基础上,通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进一步纯化,并结合电洗脱技术,利用灵敏的杀菌活性检测手段,从家蝇抗菌肽总组分中分离纯化出1个20 ku的抗菌肽,对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌均有杀灭作用。

肝脏表达抗菌肽2 (liver-expressed antimicrobial peptide 2， LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2 (Acipenser gueldenstaedti LEAP-2， AgLEAP-2)的全长cDNA序列，对其序列特征和表达水平进行了分析；构建AgLEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化；进一步采用琼脂稀释法初步检测AgLEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示，AgLEAP-2基因cDNA全长为622 bp，开放阅读框(open reading frame， ORF)为246 bp，预测编码81个氨基酸，分子量约为11.2 kDa，5′端非编码区为184 bp，3′端非编码区为192 bp。AgLEAP-2包含一个信号肽(1～25 aa)和一个成熟肽(26～81 aa)，成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基，在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示，AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达，在肝脏中表达水平最高，在肠道和肌肉中表达水平次之，在鳃中表达量最低。与0 h相比，AgLEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外，重组AgLEAP-2 (rAgLEAP-2)蛋白在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明，AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果，本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。

以黄鳝皮肤黏液为材料,通过Sephadex G-50凝胶层析和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析,分离纯化了具有抗菌和镇痛活性的多肽MAS-Ⅳ-4,用Tricine-SDS-PAGE测得其分子量为10.4kD,用显微熔点仪测得其熔点为208~211℃。用抑菌圈法测定其抑菌活性,结果表明,MAS-Ⅳ-4对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的抑菌效果。此外,每只注射0.75ml以上的MAS-Ⅳ-4样品液能显著提高小白鼠的痛阈值。MAS-Ⅳ-4还具有微弱的溶血活性和丝氨酸蛋白酶抑制活性。

抗菌肽是鱼类先天免疫的组成部分,发现新的抗菌肽对于动物抗病机理的研究和寻找新药物有重要意义。经过对GenBank数据库中牙鲆EST文库进行同源比对后,筛选得到一个具有完整编码框的抗菌肽cDNA序列,结果再经过RT-PCR进行验证,命名为LEAP-2,对该序列进行注释,获得序列登录号EU586111。该抗菌肽能编码102个氨基酸的多肽,前28个氨基酸组成信号肽。推测编码蛋白质分子量为11 276.9 u,理论等电点(PI)为9.33。其蛋白质序列与另外9种鱼类的同源抗菌肽序列比较发现,同源性介于38.2%～61.7%。其中57至92位氨基酸为高度保守区,是维持其空间结构的主要区域,其中包含有4个...

为了分离纯化及鉴定枯草芽孢杆菌BSD-2代谢产物中抗菌肽,采用盐酸沉淀、Sephadex G-50层析以及反相HPLC对其进行分离纯化,并利用Tricine-SDS-PAGE、MAIDL-TOF-MS、红外光谱和核磁共振技术对其分子量、氨基酸序列以及结构进行初步解析。结果显示该抗菌肽是由29个氨基酸组成,分子量为3 514 Da,等电点为10.46。红外光谱和核磁共振分析其结构中含有-CH2-、-CH3、-OH、-NH2、-CH、-CO-以及苯环等官能团。

【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、...

从蚯蚓体内分离纯化30 kD以下的抗菌肽,并研究其抑菌效果.通过电击诱导蚯蚓产生抗菌肽、超滤浓缩脱盐以及截取3～30 kD的抗菌肽、用阳离子交换分离除去较多杂蛋白、凝胶过滤层析进一步精确分离提纯得到3~30 kD的蚯蚓抗菌肽,有H1和H2两个蛋白浓度较高的峰值.测得其蛋白质量浓度分别为6.82、7.46 mg/μL,其相对分子质量分别在5 856～7 823 kD和14 40～20 00.抑菌活性测定结果表明,H1和H2都有较好的抑菌效果,其中H1对草枯杆菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌有明显的抑菌效果,H2对巴氏杆菌、大肠杆菌和草枯杆菌也有明显的抑菌效果,H1的抑菌活性比H2高.

采用75%乙醇沉淀、阴离子交换色谱层析和阳离子交换色谱层析等方法,分离并纯化侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospours)2-Q-9菌株外泌抗菌肽BL2Q9。结果表明,BL2Q9的相对分子质量为7 800,等电点为10.2。Edman降解测序发现其N末端封闭,串联质谱测序结果表明其与细菌第Ⅳ类鞭毛合成蛋白pilQ的前体蛋白以及转录抑制子CodY蛋白的部分序列相似,但与已知抗菌肽的序列相似性较低。

以水产病害的病原菌为目标菌,从中国对虾(Penaeus chinesis)体液中分离筛选抗菌肽,通过Sephadex G-50、RP-HPLC等分离纯化技术,得到一种抑制水产病原菌的抗菌肽PC-V-2。经初步鉴定,该抗菌肽具有广谱抗性,不仅抗鲁克氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri),而且对金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subttilis)等革兰氏阳性菌,大肠杆菌(Escherichia coli)等革兰氏阴性菌和白色念珠菌(Candida albicans)等真菌也有较强的抗性。另外,该抗菌肽还有一定的抑制凝血的活性,但没有检...

【目的】分离纯化牛乳酪蛋白酶解物,检测酶解物及其分离组分的抑菌活性,并制备抗菌肽乳基料。【方法】从中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及木瓜蛋白酶中筛选一种蛋白酶水解牛乳酪蛋白,将其酶解产物经大孔吸附树脂和凝胶过滤色谱分离、纯化后,以对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)为指标,分析酶解物和分离组分的抑菌活性。【结果】(1)木瓜蛋白酶水解牛乳酪蛋白4.5h,其酶解物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用。(2)大孔吸附树脂将牛乳酪蛋白酶解物分离成4个组分,其中以体积分数75%乙醇洗脱组分的抑菌作用较强。(3)凝胶过滤色谱将体...

对混合菌液诱导和非诱导处理的喙尾琵甲幼虫抗菌肽进行了分离纯化及抑菌活性比较。结果显示:诱导组和非诱导组粗提物无抑菌活性,但是经凝胶色谱分离后,从非诱导组获得组分DZP1,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌表现出抑制作用;从诱导组获得组分YDP1,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌具有活性,且YDP1活性明显强于DZP1;Tricine-SDS-PAGE检测表明DZP1和YDP1组成、种类基本一致,主要由20 kD以下分子量的小肽组成。研究结果表明:喙尾琵甲幼虫在诱导和非诱导条件下均可分离到具有抑菌活性的抗菌肽,菌液诱导可增强抗菌肽的活性和抑菌谱。