急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease， AHPND)严重影响了我国乃至全球对虾养殖业的发展。近期研究发现，致病菌毒力质粒携带trb型Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ secretion system， T4SS)，可在高菌体密度下介导毒力质粒发生接合转移，从而导致AHPND致病菌多样性。为探究群体感应与T4SS表达以及毒力质粒接合转移的关系，本研究以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)群体感应系统的高密度调控子OpaR为研究对象，在致AHPND副溶血弧菌20130629002S01::cat(Vp2S01::cat)菌株基础上，利用同源重组技术构建opaR基因缺失株Vp2S01::catΔopaR。比较了出发菌株和缺失株在生长性能、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异，分析了opaR基因对T4SS基因表达量以及质粒接合转移效率的影响。结果显示，opaR基因缺失不影响细菌的生长特性和群集运动，但泳动能力显著增加，生物被膜形成能力显著下降；接合转移实验显示，opaR基因缺失显著提高T4SS表达水平和接合转移效率。本研究为解析群体感应系统调控AHPND致病菌T4SS表达以及毒力质粒接合转移机制提供了基础数据，可为控制AHPND致病菌毒力质粒传播提供技术支撑。

为探究鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220的分子特征、生物学功能及对细菌毒力的影响，通过PCR扩增了鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220基因，分析了其分子特征，利用TargetRNA2网站预测STnc1220基因可能调控的靶基因；利用λ-Red同源重组技术构建沙门菌(STM)-基因缺失突变株，并与亲本SL1344比较，对其生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物被膜(BF)形成能力、在不同应激环境中(pH值、H_2O_2、高盐和乙醇胁迫环境)的适应性、通过黏附侵染巨噬细胞和小鼠感染试验对致病力进行研究。结果显示，STnc1220基因全长73 bp、其上游5′-UTR存在-10和-35启动子结合位点，预测其潜在的靶基因为barA基因；试验成功构建缺失株STM-ΔSTnc1220,且具有良好的遗传稳定性；与SL1344亲本株相比，缺失株的生长速度、生化特性及生物被膜形成能力没有发生改变；在pH=4.8,pH=9和H_2O_2条件下生长速率差异不显著，但在4%NaCl环境下，缺失株在7 h后生长速率明显高于亲本株，在3.8%乙醇环境中缺失株在对数期的生长速率显著升高(P<0.05);其对巨噬细胞中黏附和侵袭能力极显著降低(P<0.01),小鼠LD_(50)显著升高，对小鼠的肝脏和脾脏的病理损伤致病力减弱。表明STnc1220基因在环境适应性和毒力调控中发挥了重要的作用。为阐明鼠伤寒沙门菌的致病机制提供理论依据。

[目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶血弧菌SH112株的omp A基因缺失株和互补株,开展对该基因在细菌生长特性、生物被膜形成、运动性、血清杀菌、细胞黏附、细胞毒性,组织载量以及小鼠致病性等相关生物学特性和致病性的影响研究。[结果]omp A的缺失不影响副溶血弧菌的生长速度、生物被膜形成能力和运动性。野生株和Δomp A的黏附和抗血清试验结果无显著差异。但Δomp A对Caco-2细胞的毒性作用显著低于野生株。小鼠染毒验结果显示,与感染野生株的小鼠相比,感染Δomp A的小鼠症状明显减轻,存活率更高,Δomp A在小鼠血液和肝脏中的带菌量显著低于野生株,而互补株的毒力恢复至野生株水平,表明omp A缺失能显著降低副溶血弧菌的毒力。[结论]omp A与副溶血弧菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。

从发病桑椹上分离纯化出一株真菌,对其进行形态学、分子生物学鉴定,此菌株为一种桑椹致病菌,为桑茎点霉Phomam oricola。对该菌株的生物学特性研究发现,菌株在多种培养基上均可以生长,在PDA和燕麦培养基生长最适合;适合温度为18~23℃,最适pH值为6,最适碳、氮源为淀粉和NaNO3。

为了深入研究稻曲病菌生物学特性,为防治稻曲病提供科学依据,本研究从不同致病力稻曲病菌中,挑选了3个致病力强、3个致病力弱的菌株,从不同温度、pH、碳源、氮源对不同致病力的稻曲病菌进行研究。结果表明,稻曲菌菌丝生长的最适温度均为28℃,在7 d内致病力弱的菌株生长速率较快,菌丝生长的最适pH为6~7。致病力弱的菌株的最适氮源为牛肉浸膏,致病力强的菌株的最适氮源为蛋白胨,KNO3不为稻曲病菌提供氮源,尿素抑制稻曲病菌的生长。在氮源充足的条件下,稻曲病菌可以利用多种碳源,乳糖不能为稻曲病菌提供碳源,致病力弱的菌株的最适碳源为蔗糖,致病力强的菌株的最适碳源为葡萄糖。

为了解非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子伴侣蛋白Hfq在LM毒力中发挥的调控作用,在构建LM-Δhfq缺失株的基础上,通过动物攻毒试验检测野毒株LM-SB5与缺失株LM-Δhfq对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;通过溶血试验检测二者的溶血活性;通过结晶紫染色的方法检测二者的生物被膜生成能力。以分析hfq基因缺失对LM毒力及生物被膜生成的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-Δhfq对小鼠的LD50升高了6.067倍,毒力显著降低;肝、脾载菌量在第2

为筛选适用于研究地榆(Sanguisorba officinalis L.)对对虾急性肝胰腺坏死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus, VP_(AHPND))抑制机理的内参基因,本文探究了地榆醇提物胁迫下VP_(AHPND)生长的变化,并利用qRT-PCR技术探究了该条件下VP_(AHPND)中6种常见内参基因(rec A、pvs A、pvu A、gapdh、16S rRNA和rpo S)的表达情况,利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。结果显示,地榆醇提物能抑制VP_(AHPND)的生长,且抑制效果与浓度呈正相关。在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这6种内参基因扩增产物特异性良好,其中,Ct值变化差异最小的为16S rRNA (CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A (CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中,GeNorm给出的稳定性排序为rpo S=16S rRNA> gapdh> rec A> pvu A> pvs A;Norm Finder结果为gapdh> rpo S> pvu A> 16S rRNA> rec A> pvs A;Best Keeper结果为16S rRNA> rpo S> gapdh> rec A> pvu A> pvs A;Delta Ct结果为gapdh> rpo S> pvu A> 16S rRNA> rec A> pvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo S> gapdh> 16S rRNA>pvu A> pvs A> rec A。本研究根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo S和gapdh作为该条件下内参基因。本研究为以地榆为核心药物的AHPND防控技术的建立和从基因表达角度研究地榆对VP_(AHPND)的作用机理提供了基础。

皮特不动杆菌作为一种新兴的鱼源致病菌，为了对该菌的致病机理进行深入研究并给该菌引起的鱼类疾病防治提供技术储备，本研究选取皮特不动杆菌菌株Ap-W20进行了全基因组测序，并对其毒力特征进行了分析。结果发现，Ap-W20全基因组序列总长为4 399 705 bp，GC含量为38.78%，共预测到4 230个编码序列(CDS)，存在4个质粒，GenBank数据库登录号为CP027658–CP027662。ANI分析结果证实Ap-W20属于皮特不动杆菌，且Ap-W20与已知人源皮特不动杆菌AP＿882(96.69%)和环境源皮特不动杆菌PHEA-2(96.55%)相似度较高。Ap-W20与AP＿882、PHEA-2的比较基因组学分析发现，Ap-W20中的基因岛、前噬菌体和质粒数量最多，这很可能与它们各自的分离环境和致病力有关。通过与毒力因子数据库(VFDB)数据库比对，在Ap-W20全基因组中预测到286个毒力基因，主要与黏附和抗吞噬等有关。Ap-W20中还存在I、II和VI型分泌系统、多套双组分调控系统以及细菌素合成基因簇等，表明鱼源皮特不动杆菌可能存在复杂的致病机制。本研究对鱼源皮特不动杆菌全基因组进行了毒力特征分析，为该菌引起的鱼类疾病防治奠定了基础。

为检测产后奶牛子宫内膜炎致病菌的毒力基因和耐药性,在生产3周后采用棉拭子法对65头确诊的临床型子宫内膜炎荷斯坦奶牛进行子宫黏液的采集;分别用阴门灌注大鼠子宫试验、PCR方法以及药敏纸片法来检验分离株的致病性。结果表明,灌注混合菌(1∶1,1.0×109 cfu/mL)72h后剖解大鼠子宫发现子宫充血,肿大,增厚,子宫内部有蓄脓现象。然而,Escherichia coli和Staphylococcus aureus从患病牛中最终检出率分别为58.69%、62.75%;并对27株致病性E.coli系统发育组C

[目的]构建禽致病性大肠杆菌(APEC)Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录因子eivF缺失株,并对其进行生物学特性及转录组学分析,探究转录因子eivF基因在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。[方法]利用Red同源重组技术构建APEC ETT2转录因子eivF基因缺失的APEC AE81△eivF株及其回复株AE81 C-eivF,通过运动性、生物被膜形成等试验分析eivF对APEC生物学功能的影响;并利用转录组学方法分析eivF在转录调控网络中对细菌鞭毛和生物被膜等相关因子的转录调控作用。[结果]成功构建了APEC eivF基因缺失株AE81△eivF和回复株AE81 C-eivF;生物学结果表明,与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF运动能力降低,生物被膜形成褶皱堆砌且厚度增大,空间结构呈立体、多层次状,并形成类似于三维塔状结构的突起,回复株AE81 C-eivF运动能力和生物被膜形成能力基本恢复;与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF有576个基因差异表达,且鞭毛和生物被膜等相关基因在转录水平上均发生显著变化。[结论] ETT2的转录因子eivF参与调控APEC的生物表型变化,其可能通过调控鞭毛、生物被膜相关基因而调控APEC致病过程。

通过野外调查和室内饲养观察 ,掌握了危害雷竹的沟金针虫的形态特征和生物学特性。沟金针虫一般 2～ 3a完成 1个世代 ,以幼虫或成虫在土中越冬。室内用绿僵菌Mf2 菌株对沟金针虫进行毒力测定 ,结果表明 :绿僵菌 1 0× 1 0 8个·mL-1和 1 0× 1 0 7个·mL-2 2种浓度的孢子液对沟金针虫均有明显致病力。图 1表 2参 8

对引起云南省元江县芦荟炭疽病的病原菌进行了生物学特性及室内药剂毒力测定研究。结果表明:引起该地芦荟炭疽病的菌原是芦荟炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioidesPenz.,其生长的适宜温度范围为25~35℃,最适温度为30℃,致死温度为60℃、10 min;病菌能有效地利用各种碳源和氮源,最适碳源是麦芽糖,最适氮源是硝酸钠。70%代森锰锌对菌落抑制效果最佳,其次75%百菌清,80%比超也有一定抑制效果。

嗜水气单胞菌是水环境常见的病原体，具有较强致病性。在本研究中，首次敲除了嗜水气单胞菌aguA基因，通过转录组分析发现aguA敲除后细菌的粘附、致病、胺代谢等生物过程下降。通过qRT-PCR进一步验证发现10个粘附基因、9个发病基因和8个胺代谢基因的mRNA表达水平明显下降；此外，转录组水平分析结合qRT-PCR验证发现VI型分泌系统基因、II型分泌系统基因、鞭毛合成相关基因、菌毛合成相关基因、溶血基因、I型分泌系统基因、肠毒素基因、RTX基因等毒力基因的RNA表达水平也出现下调。对两株菌进行草金鱼的体内感染实验，与野生菌株（WT）相比，aguA敲除株（△aguA）感染草金鱼的致病力降低了7.47倍，且aguA敲除株生物膜形成能力降低了16.6%。以上结果显示aguA基因与嗜水气单胞菌的致病性密切相关。

[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒I型（FHV-1）弱毒疫苗，本研究利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白RFP。[方法]试验构建了针对gIgE基因的3 条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒，将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞（F81），通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化，以重组毒感染F81细胞连续10 代验证其遗传稳定性，通过测定重组毒以及亲本毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]试验结果显示，FHV-1 gIgE基因缺失毒株得到成功构建并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP；提取重组毒DNA通过PCR验证gIgE基因无目的条带，表明重组毒纯化成功，再通过PCR验证RFP基因有目的条带，表明重组毒成功插入外源基因；病毒滴度测定结果显示，与亲本毒相比重组毒的病毒滴度下降了10倍；在F1～F10连续传代过程中可观察到RFP荧光表达且无减弱现象，表明重组毒可稳定表达外源基因；测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线，重组毒的生长趋势与亲本毒大致相同，表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性；噬斑观察及染色结果显示，无论是在病毒感染细胞前期还是后期，重组毒的噬斑都要小于亲本毒，表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]上述结果说明，本研究成功构建并筛选出了FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株，为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了坚实平台与基础。

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血