【目的】通过探究miRNA-424-5p对奶牛母体胎盘组织胶原蛋白降解的影响，进而明确miRNA-424-5p对奶牛胎衣不下（retained fetal membranes,RFM）发生的调控作用及机制。【方法】检测胎衣正常排出与胎衣不下奶牛母体胎盘组织miRNA-424-5p表达水平，采用qRT-PCR和Western blot方法进行胎衣正常排出与胎衣不下奶牛的母体胎盘组织VEGFA、MMP-2、MMP-9、COL-IV的表达水平检测。应用生物信息学分析对miRNA-424-5p进行靶基因预测，并通过双荧光素酶试验验证miRNA-424-5p与VEGFA的靶向关系。在奶牛子宫内膜上皮细胞中转染miRNA-424-5p mimics和miRNA-424-5p inhibitor进行过表达和沉默miRNA-424-5p。采用免疫荧光技术观察VEGFA在奶牛子宫内膜上皮细胞的表达变化，qRT-PCR和Western blot检测VEGFA、MMP-2、MMP-9、COL-IV的mRNA与蛋白表达水平的变化。【结果】与健康组相比，RFM组母体胎盘组织中的miRNA-424-5p mRNA表达水平显著升高（P<0.01),VEGFA、MMP-2、MMP-9 mRNA与蛋白表达水平极显著降低（P<0.01),COL-IV mRNA与蛋白表达水平极显著升高（P<0.01)。miRNA-424-5p的潜在靶基因共有152个，并经双荧光素酶试验结果证实VEGFA是miRNA-424-5p的靶基因。过表达和沉默miRNA-424-5p后，免疫荧光结果显示，与对照组相比miRNA-424-5p mimics组VEGFA的表达较低，而miRNA-424-5p inhibitor组VEGFA表达较高；qRT-PCR和Western blot结果显示，过表达miRNA-424-5p，靶基因VEGFA mRNA与蛋白表达水平极显著降低，基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9 mRNA与蛋白表达水平极显著降低（P<0.01)，胶原蛋白COL-IV mRNA与蛋白表达水平极显著升高（P<0.01)，而沉默miRNA-424-5p时VEGFA、MMP-2、MMP-9 mRNA与蛋白表达显著升高（P<0.01),COL-IV mRNA与蛋白表达水平极显著降低。【结论】miRNA-424-5p可靶向VEGFA调控MMPs表达、胶原蛋白的分解从而引起细胞外胶原降解障碍，是引起胎衣不下发生的重要因素。

从氧化应激的角度深入探讨了胎衣不下的发病机理。分别对胎衣不下(RFM)的奶牛(n=20)和胎衣正常排出的奶牛(n=20)各随机选择5头,通过原子吸收光谱法测量两组牛分娩时和分娩后12 h的血清中8种金属元素K、Na、Ca、Mg、Cu、Fe、Zn和Mn的含量,同时用722可见分光光度计对两组牛分娩时血清中的抗氧化指标进行了检测。实验结果表明,RFM组的Mn、Zn和Cu含量显著低于正常对照组(P<0.01),RFM组血清Ca和Mg也显著低于胎衣正常排出组(P<0.05);但是RFM组Fe血清含量要极显著高于阴性对照组(P<0.01);RFM奶牛血清中抗氧化酶Zn-SOD、Cu-SOD及总SOD和G...

为探究胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盘产物间差异,用此3种酶在最优条件下酶解奶牛胎盘获得胎盘酶解产物,每种酶重复3次,利用LC-MS/M技术鉴定产物中蛋白和肽段,BIO-PEP数据库匹配和测算十肽及以下的抗氧化活性多肽。结果显示:胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物分别鉴定出541、137和86种蛋白,2 766、1 170和128个肽段,胰蛋白酶鉴定蛋白和肽段数极显著高于其余2种酶(P<0.01),木瓜蛋白酶鉴定蛋白和肽段数均显著低于其余2种酶(P

为探索草鱼出血病防治新技术,实验采用衣壳蛋白靶向灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVI)策略,利用Tgf2转座子元件,构建了带爪蟾EF1α或鲤热休克蛋白70两种不同启动子的CTVI转基因质粒p Tgf2-EF1α-VP3-SN或p Tgf2-Hsp70-VP3-SN。该2种质粒均包含GCRV衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SN)融合表达阅读框。通过将2种CTVI转基因质粒与体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA共同显微注射入草鱼1~2细胞期受精卵,获得了带2种不同启动子的CTVI...

【目的】通过研究不同加热温度和加热时间来探究胶原蛋白特性对嫩度的影响,为中国高熟度牛肉嫩度特性研究提供参考。【方法】将牛半腱肌肉在60、70、80、90和100℃水浴温度下分别加热30、60、90、120和150 min,通过测定剪切力、蒸煮损失、水分含量、质构特性、结缔组织机械强度、胶原蛋白含量及热溶解性、胶原蛋白共价交联以及扫描电镜等指标探究嫩度的变化规律,通过相关性分析得出影响嫩度的关键因素。【结果】随着加热温度的升高和加热时间的延长,牛半腱肌肉剪切力降低,蒸煮损失增大,水分含量降低;总胶原蛋白和不

【目的】采用响应曲面法对鹿角盘胶原蛋白酶解提取工艺进行优化。【方法】以马鹿鹿角盘为原料,胶原蛋白提取率为指标,选取料液比、pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间5个因素进行单因素试验,确定各因素的最优提取条件。在单因素试验的基础上,选取pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间为影响因素,进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计,采用响应曲面法分析4个因素对胶原蛋白提取率的影响。【结果】单因素试验结果表明:料液比1∶20、pH值1.8、加酶量4%、酶解温度37℃、酶解时间为6h时胶原蛋白提取率最高。响应曲面法得到的最佳提取工艺为:pH 1.77、加酶量3.94%、酶解温度36.78℃、酶解时间5....

在体外,将μ-钙激活酶用不同浓度的氧化剂(0μmol·L-1H2O2+0μmol·L-1Fe2+、300μmol·L-1H2O2+600μmol·L-1 Fe2+、400μmol·L-1 H2O2+800μmol·L-1 Fe2+、500μmol·L-1 H2O2+1 000μmol·L-1 Fe2+)氧化,并用其孵育分离纯化的牛肉肌原纤维蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting分析氧化的μ-钙激活酶对肌原纤维蛋白降解的影响。结果表明:随着氧化剂浓度的升高,μ-钙激活酶降解肌间线蛋白和肌钙蛋白T的能力减弱,同时相对分子质量为30×103肌钙蛋白T降解的产物减少。表明,μ-钙...

【目的】通过对花纹肉剪切力值与胶原蛋白吡啶交联含量的对比研究,发掘脂肪沉积改善牛肉嫩度的内在原因。【方法】以秦川公牛花纹肉为试验材料,研究相同年龄不同花纹等级、相同花纹等级不同年龄的牛肉样品剪切力值、胶原蛋白热溶解性以及吡啶交联含量的变化规律。【结果】对花纹等级相同(B级)的西冷来说,随着年龄的增长,羟赖氨酰吡啶嗡(HP)交联逐渐增加,赖氨酰吡啶嗡(LP)交联先增加后减少,胶原蛋白热溶解性下降,牛肉剪切力值增加;对相同年龄的西冷来说(4对永久齿),随着花纹等级的提高,HP交联含量逐渐减少,胶原蛋白热溶解性升高,牛肉剪切力值下降。【结论】脂肪沉积过程中,胶原蛋白中HP交联受抑,胶原蛋白未能形成丰...

采用胃蛋白酶在酸性条件下酶解提取刺参体壁胶原蛋白并对其分离纯化,然后将胶原蛋白分别在不同温度下进行热处理,经SDS-PAGE电泳和傅立叶变换红外扫描等方法分析热处理前后胶原蛋白的生化特征。结果显示,提取的胶原蛋白具有较高的纯度,且存在完整的三股螺旋结构;胶原蛋白在40℃热处理条件下不仅二级结构被破坏,一级结构也被部分破坏,α链和β链条带消失,分子量降低(<100kDa);70℃达到了各种肽链叠加所表现出的热收缩温度,肽链发生聚集、收缩,分子量开始升高;80℃加热条件下,肽链进一步收缩,分子量达到120kDa左右,而且仍保持一定量的二级结构;当温度超过100℃时,胶原蛋白一级结构被严重破坏。

为探讨不同交联方法对草鱼皮胶原蛋白海绵材料性能的影响,实验以草鱼鱼皮为原料,提取、纯化胶原蛋白并制备胶原海绵材料。在此基础上,分别用紫外交联、热交联、戊二醛交联以及EDC/NHS交联方法处理胶原海绵,通过测定材料的交联度、热变性温度、拉伸强度和体外抗酶降解性能,比较了不同方法的交联效果。结果发现,提取所得的草鱼皮胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原;经不同方法交联处理后,海绵材料交联度依次为戊二醛(72.0%)>EDC/NHS(32.5%)>热交联(29.9%)>紫外交联(15.6%);与对照胶原材料相比,戊二醛处理后,胶原材料的热变性峰值温度(67.4℃)、最大拉伸强度(125.6 kPa)和体外抗酶降...

以罗非鱼鳞为原料,提取酸溶胶原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)和酶促酸溶胶原蛋白(pepsin-soluble collagen,PSC),并对PSC的理化性质及其酶解产物抗氧化性进行探讨。实验结果表明:0.1 mol/L HCl提取ASC和PSC的得率分别为3.52%和14.88%;PSC氨基酸组成中,每1000个氨基酸残基甘氨酸为351个,亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸为180;PSC强吸收峰在205 nm处,磷酸盐缓冲液检测PSC的性质,与I型胶原蛋白相符。PSC经胃蛋白酶水解3 h,过氧化抑制率达到82.8%,抗氧化效果略优于等量的Vc。

[目的]本试验旨在探讨宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)对猪胎盘细胞增殖、凋亡及抗氧化基因和蛋白表达的影响。[方法]从刚分娩的母猪中选择正常初生重(normal birth weight, NBW)和IUGR仔猪对应的胎盘各5个,分为对照组和宫内发育迟缓组。采用免疫组化法检测胎盘细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,采用TUNEL法检测胎盘细胞凋亡,采用荧光定量PCR检测胎盘NRF2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2、GCLC和GCLM基因的表达,用Westen blot(WB)检测胎盘抗氧化蛋白NRF2和HO-1的表达。[结果]对照组可以观察到较强的PCNA染色,宫内发育迟缓组PCNA染色较弱。IUGR组和对照组凋亡细胞指数分别为19.63%与12.56%,IUGR组细胞凋亡率明显高于对照组(P0.05)。WB结果显示,对照组与宫内发育迟缓组NRF2和HO-1蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。[结论]IUGR会降低猪胎盘细胞增殖,增加猪胎盘细胞凋亡且降低猪胎盘抗氧化基因的表达。

针对海参自溶现象,研究海参内脏中与胶原降解相关蛋白酶的存在情况,以期了解内源性蛋白酶在海参自溶过程中发挥的作用,为解明自溶的内在机理提供理论依据。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析、Phenyl Sepharose FF疏水柱层析及M ini Q离子交换柱层析等方法,从海参内脏中分离纯化出降解明胶的蛋白酶。利用荧光底物研究其酶学性质及其对海参体壁胶原蛋白的降解情况。结果表明,该酶最适温度为30℃,最适p H为7.5,可被金属蛋白酶抑制剂EDTA、EGTA完全抑制,亦可被PM SF、Pefabloc SC等丝氨酸蛋白酶抑制剂...

针对加工副产物鲍鱼外套膜利用率低的现象，对鲍鱼腹足和外套膜胶原蛋白相关性质进行比较研究，以期为鲍鱼的综合加工提供一定的理论依据。本研究以皱纹盘鲍为原料分别提取得到腹足酶促溶性胶原蛋白（ｐｅｐｓｉｎ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｆ ａｂａｌｏｎｅ ａｄｄｕｃｔｏｒ，ｐｓｃ１）和外套膜酶促溶性胶原蛋白（ｐｅｐｓｉｎ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｆ ａｂａｌｏｎｅ ｍａｎｔｌｅ，ｐｓｃ２），对ｐｓｃ１和ｐｓｃ２相关特性进行比较分析，并利用ｐｓｃ１制备得到兔抗鲍鱼胶原蛋白多克隆抗体。ｓｄｓ－ｐａｇｅ显示，ｐｓｃ１和ｐｓｃ２分子组成均为（α１）３，且α１的分子量为１４０ ｋｕ，与水产无脊．．．

以日本鳗鲡皮与肌肉组织为研究对象,采用碱溶、酸溶、盐析、冻干等方法纯化得到胶原蛋白,采用加热、饱和硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析等方法纯化得到两种亚型的小清蛋白(PV-Ⅰ和PV-Ⅱ),纯化的目标蛋白经动物特异性抗体的免疫印迹实验确证。酶联免疫吸附测定和免疫印迹分析结果显示,纯化的胶原蛋白和小清蛋白分别与鱼类过敏患者阳性血清发生特异性反应,且二者之间无免疫交叉反应。体外模拟胃液消化实验和SDS-PAGE分析结果显示,胶原蛋白和小清蛋白均具有较高的消化稳定性。结果提示,日本鳗胶原蛋白和小清蛋白具有较高的消化稳定性和免疫原性,二者可引发不同患者的IgE介导特异性超敏反应。