【目的】通过碱性调宁蛋白(h1-calponin)基因与五指山小型猪骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)成骨分化关系的研究,探讨成骨分化机制。【方法】添加成骨分化液对BM MSCs进行成骨分化诱导,采用茜素红染色的方法鉴定细胞成骨分化的程度;通过定量PCR分析h1-calponin基因及成骨相关基因骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、核心结合因子α1(core binding factor a1,Cbfα1)及核心结合因子β(core binding factor beta,C...

为探究猪（Sus scrofa）骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, PBMSCs）成软骨分化过程中能量代谢动态变化以及与软骨形成之间的关系，本研究分离并鉴定猪骨髓间充质干细胞，并通过建立诱导分化培养体系获得猪软骨细胞。对PBMSCs成软骨诱导分化第1、6、12和18天的细胞进行软骨形成标记基因、能量代谢相关基因表达模式分析以及能量代谢产物含量检测，且对软骨形成标记基因与能量代谢产物进行相关性分析。结果表明：1）在成软骨分化过程，软骨形成标记基因II型胶原α1链（Collagen type II alpha 1 chain,COL2A1）、SRYbox转录因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)、聚集蛋白聚糖（Aggrecan,ACAN）、基质金属蛋白酶13(Matrix metallopeptidase 13,MMP13)、RUNX家族转录因子2(RUNX family transcription factor 2,RUNX2)表达水平显著提高（P<0.05）；糖酵解限速酶基因己糖激酶1(Hexokinase 1,HK1)、丙酮酸激酶L/R(Pyruvate kinase L/R,PKLR)和乳酸转运关键基因溶质载体家族16成员1(Solute carrier family 16 member 1,SLC16A1)表达水平显著提高（P<0.05），葡萄糖转运关键基因溶质载体家族2成员4(Solute carrier family 2 member 4,SLC2A4)表达水平显著降低（P<0.05）;2）随着成软骨分化时间增加，胞内ATP含量和葡萄糖含量显著降低（P<0.05），胞内乳酸、乳酸和葡萄糖比率显著增加（P<0.05）。3）成软骨分化关键基因与能量代谢产物的相关性分析表明，PBMSCs成软骨过程与糖酵解代谢显著相关（P<0.05）。综上，本研究成功建立了一种诱导PBMSCs分化成软骨细胞的方法，并发现在间充质干细胞诱导成软骨细胞过程中，细胞氧化磷酸化水平逐渐降低，糖酵解代谢逐渐增强，为后续深入解析猪体长发育机制提供新视角。

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的表达。结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs。

构建含有Zic3基因的真核表达载体pEGFP-Zic3,并转染小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC),观察BMSC中Zic3的表达情况。用RT-PCR技术获得Zic3基因,并将其连接到真核表达载体pEGFP-C1中,获得真核表达载体质粒pEGFP-Zic3,采用双酶切法和DNA测序鉴定构建的载体是否正确。体外培养小梅山猪BMSC,通过免疫细胞化学法检测小梅山猪BMSC表面标志。采用脂质体法将pEGFP-Zic3转染BMSC,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在小梅山猪BMSC内的表达和定位,用RT-PCR法检测Zic3的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。双酶切和测序证实已成功构建含目的...

为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力。结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨...

【目的】建立体外分离、培养和扩增牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,研究牛龄对BMSCs增殖特性的影响。【方法】用贴壁筛选法纯化新生牛与成年牛的BMSCs,传代扩增,测定生长曲线和贴壁率,并进行形态学观察。【结果】通过体外培养,可使体内环境下低丰度的BMSCs实现扩增。新生牛BMSCs易于分离纯化,贴壁率及增殖能力显著高于成年牛。【结论】新生牛比成年牛更适于BMSCs的提取。BMSCs的增殖生长特性与年龄密切相关,增殖能力和活性随着年龄的增加而降低,成功地建立了一种分离培养牛BMSCs的方法,分析了BMSCs部分生物学特...

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。

【目的】为探讨五指山小型猪(WZSP)近交系群体中SLAⅠ3(SLA-3)位点等位基因分布结构及其特性。【方法】利用4对引物,采用RT-PCR扩增了32头WZSPSLA-3基因部分外显子1、外显子2和大部分外显子3序列。根据家系和扩增结果,选择8头个体的PCR产物克隆测序。【结果】获得9个不同的核苷酸序列。与GenBank中所用SLA-3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较分析,确定这9个序列均为SLA-3位点上的新等位基因,但这些等位基因间核苷酸变异很少;氨基酸序列比较发现猪和人之间有很高的保守性。同时,构建了23个SLA-3的等位基因和1个HLA-A等位基因核苷酸序列的系统树。【结...

【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1μg.mL-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1μg.mL-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10μg.mL-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、...

为建立鸡骨髓源树突状细胞(DC,dendritic cells)体外培养方法,用重组鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)和重组鸡白细胞介素4(rIL-4)体外诱导鸡骨髓细胞分化为DC,然后通过形态观察、表型鉴定及功能分析来初步鉴定所培养的DC。试验结果表明:培养7 d后,光学显微镜下观察到细胞表面不规则,有显著的树突状突起,呈典型的DC形态,流式细胞仪测得细胞表面CD11c和MHCⅡ分子的表达量分别为69.3%和63.0%。经脂多糖或CpG-ODN刺激24 h后的DC,其表面成熟分子标志CD40和CD86上调表达,同时其刺激同种异体T细胞增殖的能力显著增强(P<0.01)。结论:本...

【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、D...

胚胎干细胞是由早期内细胞团分离的一种多潜能细胞 ,在体外分化抑制培养时 ,可保持未分化状态而无限增殖。一旦撤除分化抑制因素 ,或添加适当的诱导剂 ,ES细胞可分化为内胚层、中胚层和外胚层的多种类型的特化细胞。文章综述了体外定向诱导 ES细胞分化为造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞和黑素细胞等的途径和方法。

为探究视黄酸（RA）在鱼类精原干细胞（SSC）增殖与分化中的作用，实验首先以三色荧光报告载体pGRY [延伸因子1α启动子驱动组蛋白H2B-绿色荧光融合蛋白、减数分裂联会复合体蛋白3（Scp3）启动子驱动嘌呤霉素红色荧光融合蛋白、精蛋白启动子驱动黄色荧光蛋白] 转染青鳉精原干细胞系SG3，获得稳转细胞SG3-pGRY，然后分别在2D与3D培养条件下检测RA信号对其增殖与分化的影响。结果显示，稳转细胞SG3-pGRY的红色荧光可监测细胞内源性Scp3的表达，且细胞仍保持干性及分化潜能，表明其可用于监测细胞分化状态。在2D培养条件下，即在细胞培养板中待细胞生长密度约90%就进行传代培养，RA可显著抑制细胞增殖，其受体α、β、γ泛抑制剂BMS493可促进细胞增殖；第48小时，RA处理可下调细胞多能性相关基因pou5f3、klf4表达，上调减数分裂相关基因dazl表达，但对其他减数分裂相关基因如scp3表达无明显影响；第8天，处理组及对照组均未能观察到红色荧光，这与已有报道RA处理体外培养小鼠SSC可显著促进Scp3表达，并进入减数分裂I期偶线期的研究结果明显不同。在3D培养条件下，即用96孔球形低吸附微量培养板进行培养，48小时后细胞成球状体聚集生长，RA、 BMS493处理组、对照组在48 h后均观察到明显红色荧光，减数分裂相关基因表达与2D相比显著上调；第8与第34天，RA处理组减数分裂相关基因表达均显著高于对照组，而BMS493处理组低于对照组。研究表明，RA信号可抑制SG3增殖，促进其分化，但不是诱导细胞发生减数分裂的关键分子。本研究不仅为鱼类SSC分化相关研究提供了良好研究模型，而且促进了对于RA信号在鱼类SSC增殖与分化中作用的深入认识。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)是借助基因导入技术将某些转录因子导入人或动物的体细胞,使体细胞重编程而得到的多能性细胞。iPS细胞来源丰富,研究表明利用不同的载体诱导系统或不同的转录因子组合,多种体细胞都可被重编程为iPS细胞,如成纤维细胞、肝细胞、角质细胞及脐带血细胞等。作为干细胞中新的一员,iPS细胞在克隆形态、基因表达模式、表面标志物、拟胚体形成、畸胎瘤及嵌合体形成(小鼠)、分化能力等方面与胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)非常相似。与胚胎干细胞一样,在特定的诱导条件下,iPS细胞在体外可被诱导分化为多种细胞...

【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对小鼠精原干细胞(SSCs)体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶(AP)染色和RT-PCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF(添加量为0,10,20,40ng/mL)或LIF(添加量为0,500,1 000,1 500U/mL)的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加G...