建立鸡卵泡膜细胞体外无血清贴壁培养模型，研究了鸡促性腺激素释放激素（cGnRH－Ⅱ）对鸡卵泡膜细胞增殖的作用。细胞在培养箱内预培养约24h后进行各项处理，继续培养72h后，分别用胰蛋白酶消化成单个细胞，然后计数。结果表明：cGbnRH－Ⅱ能促进膜细胞增殖，作用效果具有剂量依赖关系；该促进作用能被GnRH拮抗剂（G－Ant）所阻断。这提示cGnRH－Ⅱ对膜细胞增殖的刺激作用有可能通过与膜细胞上特异的GnRH受体结合而起作用的。

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原(PCNA)参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示:原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示:PCNA在原始卵泡、初级卵泡及...

【目的】卵泡发育是一个复杂的调控过程，其中绵羊卵泡颗粒细胞（granulosa cells, GCs）的增殖，分化会直接影响卵泡的发育状况。TGF-β信号通路在绵羊卵巢发育和卵泡生长过程中起着重要作用，Smad7作为TGF-β信号通路关键性的抑制基因也发挥重要作用，通过探究Smad7介导TGF-β信号通路对绵羊卵泡GCs增殖凋亡的影响，为进一步研究Smad7在卵泡GCs增殖凋亡过程中的调控作用提供依据。【方法】选取4—6月龄未怀孕的晋中健康杜湖杂交母羊20只，屠宰后采集双侧卵巢组织，分离培养卵泡颗粒细胞，FSHR细胞免疫荧光鉴定，Smad7细胞免疫荧光的表达定位，CCK8法测定细胞增殖情况，绘制生长曲线；细胞传代后外源添加不同浓度Smad7激动剂积雪草苷（asiaticoside,AS）(0、100、200、400、600 ng·mL-1)培养绵羊卵泡GCs，选择AS最佳作用浓度处理二代颗粒细胞，采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平；合成3个siSmad7，转染至卵泡GCs中，选择干扰效果最佳的，采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平。【结果】Smad7在绵羊卵泡GCs中有表达；200 ng·mL-1 AS能极显著上调Smad7在GCs的表达（P <0.01）,siSmad7-1对绵羊卵泡GCs的转染效果最佳（P<0.01）;Smad7上调能显著增加TGF-β信号通路Smad4,TFDP-1和EP300的表达量（P<0.05），极显著增加TGF-β信号通路SP1的表达（P<0.01），显著增加凋亡相关基因Caspase8的表达量（P<0.05），极显著增加凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量（P<0.01），显著升高细胞周期相关基因P21和P27的表达量（P<0.05），极显著升高细胞周期相关基因CCND2的表达量（P<0.01），而CCND1的表达量显著降低（P<0.05），极显著降低TGF-β信号通路SP1的表达量（P<0.01），显著降低凋亡相关基因Caspase8的表达量（P<0.05），极显著降低凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量（P<0.01），极显著降低细胞周期相关基因P21,P27和CCND2的表达量（P<0.01），极显著升高CCND1的表达量（P<0.01）。【结论】Smad7介导TGF-β信号通路抑制绵羊卵泡GCs增殖和促进细胞凋亡。

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L(-1))、中(10-7mol·L(-1))、高(10-6mol·L(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各

【目的】探究原花青素(proanthocyanidins,PC)对体外培养的牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs)增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响。【方法】采集性成熟荷斯坦奶牛卵巢组织,分离卵泡GCs,使用免疫荧光对其进行鉴定。用不同质量浓度(10,30,50,70和90μg/m L)的PC对牛卵泡GCs作用不同时间(12,24和48 h)后,测定GCs存活率。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测10,50和90μg/m L PC对牛卵泡GCs周期相关基因(CCND1和CCND2)、凋亡相关基因(caspase-3、caspase-9和Bim)以及类固醇激素合成相关基因(CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD)相对表达量的影响,并检测培养上清液中类固醇激素(雌二醇(E2)和孕酮(P4))的浓度。【结果】分离获得了纯度较高的牛卵泡GCs。当PC质量浓度为50μg/m L且培养24 h时,牛卵泡GCs的存活率最高。当PC质量浓度为50μg/m L时,牛卵泡GCs周期相关基因CCND1和CCND2相对表达量均极显著升高(P<0.01);凋亡相关基因caspase-3和caspase-9相对表达量均极显著降低(P<0.01),Bim相对表达量显著降低(P<0.05);E2和P4浓度均极显著增加(P<0.01);类固醇激素合成相关基因CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高(P<0.01)。当PC质量浓度为10μg/m L时,牛卵泡GCs凋亡相关基因caspase-3的相对表达量显著降低(P<0.05);P4浓度显著增加(P<0.05);CYP19A1和3β-HSD相对表达量均显著升高(P<0.05),CYP11A1和STAR相对表达量均极显著升高(P<0.01)。当PC质量浓度为90μg/m L时,E2浓度显著增加(P<0.05),P4浓度极显著增加P<0.01);CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高(P<0.01)。【结论】50μg/m L PC通过促进牛卵泡GCs周期相关基因的表达和抑制凋亡相关基因的表达而促进牛卵泡GCs的增殖。10～90μg/m L PC通过促进类固醇激素合成相关基因的表达而促进了牛卵泡GCs合成和分泌类固醇激素,进而影响牛卵泡GCs类固醇激素合成与分泌功能。

[目的]探究牛卵巢小黄体细胞(SLCs)和膜细胞(TCs)中的差异表达基因,进而筛选与TCs黄体化密切相关的基因,为深入研究SLCs、TCs特异性及TCs向SLCs分化的机制提供参考。[方法]利用R软件limma包中的DESeq2,筛选GEO芯片数据库GSE83524数据集TCs和SLCs中的差异表达基因,再用goseq软件对筛选出的差异表达基因进行GO功能富集分析,用kobas软件进行KEGG信号通路分析,使用String结合Cytoscape软件进行PPI网络互作分析。采集思南黄牛颗粒细胞(GCs)和TCs,以RPLP0作为内参基因,用荧光定量PCR法对筛选出的与TCs增殖及黄体化相关的基因进行验证。[结果]共筛选获得237个差异表达基因,其中表达上调的基因115个,表达下调的基因122个。GO功能分析结果显示,参与生物学过程的有147个基因,占差异表达基因总数的53.6%,分别富集于30个组;参与细胞组分的有125个基因,占差异表达基因总数的21.4%,分别富集于12个组;参与分子功能的有98个基因,占差异表达基因总数的25.0%,分别富集于14个组。KEGG分析共发现17条通路,其中可能与卵泡内膜细胞黄体化相关的通路为FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1等4个基因参与的卵巢类固醇生成通路。经过PPI网络互作分析,筛选出了前10位的hub基因。荧光定量PCR分析结果显示,FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B和KIF20A在SLCs和TCs中的转录水平与GEO芯片数据结果一致,表现为FSHR、CYP19A1和CYP17A1在TCs中的表达量极显著高于其在SLCs中的表达量(P<0.01),PLA2G4A、BUB1B和KIF20A在TCs中的表达量亦显著高于其在SLCs中的表达量(P<0.05)。[结论]差异表达基因FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B和KIF20A在牛优势卵泡TCs增殖分化形成黄体的过程中发挥关键作用。

【目的】揭示小鼠卵泡膜细胞成熟过程中DNA甲基转移酶(Dnmts)表达的变化,并初步探讨其可能的机制。【方法】对新生昆明白小鼠第3、5及8天(days post parturition,dpp3、dpp5和dpp8)的卵巢进行切片,经H.E染色,分别观察原始、初级、次级卵泡膜细胞的形成情况,统计各级卵泡的比例并对卵泡外缘的膜细胞进行计数;半定量PCR检测成熟膜细胞特异性表达基因CYP17A1及Dnmts转录水平在dpp3、dpp5、dpp8卵巢中的变化;免疫组化观察Dnmt1蛋白在dpp3、dpp5、dpp8小鼠卵巢中的分布情况。【结果】小鼠dpp3卵巢中的初级卵泡外缘存在"梭形细胞";随出生...

[目的]本试验旨在解决鸡胚盘细胞(c BC)不易贴壁的问题及应用E8培养基建立新的鸡胚盘细胞培养体系。[方法]在E8培养基基础上,应用10 g·L(-1)明胶和人重组玻连蛋白(h VTN)包被培养板,对比其在促进鸡胚盘细胞贴壁速度、促进增殖和维持多功能性方面的差异。[结果]使用10 g·L(-1)明胶包被培养板后,鸡胚盘细胞12 h内即可迅速贴壁。10 g·L(-1)明胶处理组中5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01),并且能够抑制凋亡基因P21、Fas的mRN

以0.1、1.0和10.0μg/mL 3种剂量脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体处理体外培养的3T3-L1前脂肪细胞或经其诱导分化的脂肪细胞,采用四唑盐(MTT)比色法检测3T3-L1前脂肪细胞增殖能力,以乳酸脱氢酶漏出率为指标观察脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体对脂肪细胞的细胞毒性,用流式细胞仪、Hoechst 33258荧光染色分析脂肪细胞凋亡情况以及油红O染色法测定脂肪细胞脂肪含量。结果表明:用不同质量浓度(0.1、1.0和10.0μg/mL)的脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体处理可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,并影响脂肪细胞的脂肪合成(P<0.05),但对脂肪细胞无明显的细胞毒作用;还可见凋亡峰和典型的凋亡形态学改...

选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞。采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96h,用流式细胞术检测Bcl2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF1的含量。结果发现,转染Bcl2重组质粒组的Bcl2蛋白表达量和IGF1分泌量均多于其他各组。分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF1分泌量减少,而F4的IGF1分泌量基本不变。结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡...

[目的]本研究旨在明确WNT6基因在蛋鸡卵泡发育过程中的生物学功能，并对其作用机制进行初步探究。[方法]本研究以300d海兰蛋鸡为研究对象，首先检测了WNT6 mRNA在不同组织中表达特征；同时对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞进行敲减和过表达WNT6基因后，经CCK8检测细胞增殖和ELISA检测细胞培养基中的孕酮（P4）含量，以及荧光定量PCR检测卵泡刺激素受体（FSHR）和StAR、CYP11A1等基因表达量；另外，设立卵泡刺激素（FSH）浓度梯度处理体外培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞，研究FSH对WNT6和WNT通路相关基因表达量的影响。[结果]结果显示，WNT6 mRNA在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异表达，且在处于卵泡选择关键时期的小黄卵泡颗粒细胞内具有最高表达水平；与对照组相比，过表达WNT6极显著促进颗粒细胞增殖（P＜0.01），极显著提高了颗粒细胞P4合成量（P＜0.01），并显著提高FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达量（P＜0.05）；与之相反，敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制（P＜0.01），P4合成量极显著显著减少（P＜0.01），并显著降低FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达量（P＜0.05）；与此同时，本研究还发现，FSH呈剂量依赖性促进WNT6基因表达（P＜0.05），FSH还可显著提高颗粒细胞LRP1基因表达量（P＜0.05）并极显著降低FOXO1基因表达量（P＜0.01）。[结论] WNT6在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异性表达，且其表达水平受FSH调控，WNT6促进颗粒细胞增殖与类固醇激素合成，并提高颗粒细胞FSHR基因表达表达水平。本研究结果提示，WNT6协同FSH促进蛋鸡卵泡发育并调控蛋鸡卵泡选择

[目的]本试验旨在研究c-Myc在鸡卵泡上的表达及FSH对c-Myc的诱导作用，为明确c-Myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡（SWF）、大白卵泡（LWF）、小黄卵泡（SYF）、F4和F1卵泡颗粒层和膜层，检测c-Myc mRNA和蛋白的表达；应用FSH（50 ng/mL）处理小黄卵泡36 h，测量卵泡颗粒层的厚度和密度，检测颗粒层和膜层c-Myc、标记基因和周期相关基因表达；体外培养小黄卵泡颗粒细胞，敲减c-Myc 24 h后加入FSH（50 ng/mL）处理24 h，检测c-Myc 表达。[结果] c-Myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达量都显著高于排卵前卵泡，卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比，FSH增加了小黄卵泡颗粒层厚度约25.5%（P<0.05），密度约27.8%（P<0.01）。在小黄卵泡颗粒层上，FSH降低了c-Myc和类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）mRNA的表达水平（P<0.05），提高了细胞增殖抗原（PCNA）和周期蛋白D2（CCND2）mRNA的表达水平（P<0.05）。[结论]FSH能诱导c-Myc在鸡颗粒细胞中的表达，且猜测c-Myc与体外培养的鸡小黄卵泡颗粒细胞的终端分化有关。

为探索内皮素-1(ET-1)对肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)体外增殖的影响及其发挥效应的受体途径,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察ET-1对PASMC体外增殖的刺激作用,并分别观察内皮素A受体(ETAR)拮抗剂BQ123和B受体(ETBR)拮抗剂BQ788对ET-1作用下的肉鸡PASMC增殖的影响。结果表明:ET-1可显著刺激肉鸡PASMC的增殖(P0.05)。结论:ET-1具有促肉鸡PASMC增殖的作用,此作用受ETAR介导。

【目的】探讨卵丘-卵母细胞复合体(COCs)形态、卵丘细胞凋亡与增殖状态和卵母细胞发育能力之间的相关性。【方法】根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞层数等形态指标,对所挑选的未成熟COCs进行分组,随后利用体外受精技术和TUNEL技术,并结合流式细胞仪,评价各组COCs的体外发育能力及其卵丘细胞凋亡和细胞周期差异。【结果】与包被5层以上致密卵丘且卵胞质均质的COCs相比,具有2—5层轻度扩散卵丘与颗粒化卵质特征的COCs显示较好的后续胚胎发育潜力、较高的卵丘细胞凋亡程度和较低的G2-M期细胞比率。【结论】卵丘细胞凋亡程度与未成熟卵母细胞发育潜能呈正相关;COCs形态、卵丘细胞凋亡或者G2-M期细胞比率...

为探讨在卵泡期绵羊生殖器官中细胞凋亡的作用机制,本试验以小尾寒羊和萨福克羊为研究对象,采用DAPI(4′,6′-联脒-2-苯基吲哚)原位荧光标记技术,对高繁殖力品种小尾寒羊和低繁殖力品种萨福克羊成年母羊卵泡期主要生殖器官(卵巢、输卵管、子宫)进行细胞凋亡的确认与定位。结果显示:小尾寒羊和萨福克羊卵巢中卵泡上皮细胞、颗粒细胞、膜细胞均有凋亡现象。在三级卵泡和成熟卵泡的颗粒细胞和膜细胞中,萨福克羊比小尾寒羊表达出较多数量的凋亡细胞,两品种羊在卵泡期输卵管各部,子宫内膜腺体中几乎均未检测到凋亡细胞,子宫内膜基质中检测到少量细胞发生凋亡。因此,研究表明细胞凋亡是母羊生殖器官变化的重要调节机制,可能与造...