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[期刊] 华北农学报
[作者]
黄冰艳 苗利娟 张新友 严玫 翁海波 易明林 陈占宽
将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段。利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏君艺 陆璇璇 朱维宁 张林生
【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株...
关键词：
小麦 WZY2基因 RNA干扰 遗传转化
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
包梅荣 谭晓风 乌云塔娜 张琳
为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李臻 张贵林 王庆国 柳絮 李海青 姚方印 刘炜
水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。在水稻黑条矮缩病毒基因组不同双链RNA序列的基础上,分别设计了5对特异性引物,通过RT-PCR获得了相应片段,结合基因沉默的方法,分别构建RNA干扰载体,并进一步将发夹结构构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的改造后的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,成功获得了5个含有水稻黑条矮缩病干扰片段的植物双元表达载体,经农杆菌介导获得了部分水稻转化植株。旨在为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗病水稻新品种的培...
[期刊] 草业科学
[作者]
张亚楠 蔺银鼎 孟林 毛培春 田小霞 郭强
重金属ATP酶基因HMA2介导的Cd长距离运输对植物体内Cd的分配及解毒起重要作用。然而,有关马蔺(Iris lactea)体内Cd长距离运输的分子机制仍不清楚。本研究以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有IlHMA2基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARTG1G2,用冻融法将此重组质粒导入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了Il
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
向建华 高国赋 周小云 刘爱玲 邹杰 陈信波
利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高永峰 刘继恺 范晶 彭奕 黄科 张敦房 刘永胜
【目的】穗发芽是种子在收获前遇到阴雨潮湿环境时,在田间母体植株上发芽的现象,是水稻生产中的一个重要限制因素。水稻穗发芽的表现性状和玉米种子特异的viviparous1(vp1)突变体表型非常相似。VP1是种子成熟和休眠所必须的脱落酸信号转导途径中的重要转录因子,因此利用转基因技术研究水稻同源基因OsVP1的生物学功能对有效控制杂交水稻穗发芽的发生和危害具有重要意义。【方法】将水稻OsVP1片段导入到植物表达载体pHB,构建OsVP1的RNA干涉植物表达载体pHB-OsVP1RNAi;通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴,并获得阳性植株。【结果】半定量RT-PCR分析显示,转基因植株胚中的OsV...
关键词：
OsVP1 RNA干涉 农杆菌 水稻
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
徐刚标 申响保 鲍时来 张照亮
将脂质转移蛋白(LTP4)基因插入植物表达载体pBI121—35S,构建超表达载体pBI121—35S∶∶LTP4,通过农杆菌介导法将其转入拟南芥Arabidopsis thalianaColumbia生态型品种中,获得了卡那霉素筛选的抗性植株。PCR扩增验证及RT—PCR分析表明,该基因获得超表达。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张进忠 孙嘉曼 李朝生 刘挺燕 范燕萍
【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。
[期刊] 华北农学报
[作者]
公鑫 王业红 张剑峰 迟胜起
RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析，发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关，应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析，选取其共同的保守区域作为沉默对象，构建了以该保守区域为臂，马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中，应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红，以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料，经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽，将再生植株进行PCR检测，筛选得到3株阳性转基因植株；以马铃薯的ef1a基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异，在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中，RPP13基因表达量的降低幅度为35%～60%。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杜静雅 陈凯园 普金 周会英 祝光涛 张春芝 杜慧
【目的】转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新，其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛。近年来，经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白（an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFP) under ultraviolet (UV),eYGFPuv(GFPuv)）在365 nm紫外光线下能够发出强烈且稳定的绿色荧光，便于观察。构建GFPuv荧光筛选的基因编辑载体，并在马铃薯遗传转化中进行应用验证，为GFPuv荧光筛选在马铃薯转化中广泛应用提供技术支持，同时为后期利用基因组编辑技术创制马铃薯雄性不育系奠定基础。【方法】利用同源重组技术将GFPuv表达框架和基因编辑元件Cas9＿sgRNA依次与pCAMBIA2300载体连接，并进行农杆菌介导的烟草瞬时转化试验；通过发根农杆菌Ar qual和MSU440转化马铃薯茎段，在便携紫外灯下观察，并统计荧光根；利用改造载体构建了6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体，通过发根农杆菌体系转化2种马铃薯材料，验证转化效率和编辑效率；利用改造载体对马铃薯进行遗传转化。【结果】成功构建了GFPuv荧光筛选的基因编辑载体pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas，瞬时转化烟草证实GFPuv表达框架能正常表达；2种发根农杆菌的转化均筛选到绿色荧光的毛状根，加入卡那霉素（kanamycin,Kan）显著提高阳性荧光根的比例，2种菌的转化效率差异不大，但MSU440的发根形成速度更快；6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体在2种马铃薯材料中的转化效率和编辑效率是一致的，但不同靶位点的编辑效率差异较大；改造载体遗传转化马铃薯证实GFPuv荧光可用于马铃薯愈伤组织和再生苗的筛选。【结论】发根农杆菌遗传转化体系是基因编辑效率验证的重要途径，GFPuv荧光可用于马铃薯转化的筛选。
[期刊] 华北农学报
[作者]
孔丽颖 李翔 李才运 刘晓东 李月
为研究棉花ＣＢＦ２基因在植物抗逆中的作用，构建了ｐ ＣＡＭＢＩＡ１３００－Ａｔ ＣＢＦ２ｐ－ＧＢ ＣＢＦ２－Ａｔ ＣＢＦ２ｔ植物互补表达载体，并对拟南芥ＣＢＦ２突变体进行遗传转化。以新海１６ Ｃ ＤＮＡ为材料，采用ｐＣＲ的方法克隆４个棉花ＣＢＦ２基因，同时克隆拟南芥ＣＢＦ２基因启动子Ａｔ ＣＢＦ２ｐ和终止子Ａｔ ＣＢＦ２ｔ，并将这些基因与ｐ ＢｌｕｅｓＣＲＩｐｔ ｓＫ载体连接，构建ｐ ＢｌｕｅｓＣＲＩｐｔ ｓＫ－Ａｔ ＣＢＦ２ｐ－ＧＢ ＣＢＦ２－Ａｔ ＣＢＦ２ｔ中间过渡载体，用ｓＡＣⅠ和ＢＡＭ ＨⅠ双酶切中间载体，获得Ａｔ ＣＢＦ２ｐ－ＧＢ ＣＢＦ２－Ａｔ ＣＢＦ２ｔ核心片段，将此片段插入到ｐ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 苟小清 张正斌 肖向文 王晓军
小麦TaNADP-ME2是一光反应基因,并对干旱、盐、低温等非生物胁迫作出响应。构建TaNADP-ME2基因的重组植物表达载体,并转化水稻获得转基因植株。利用重组技术构建植物表达载体,冻融法转化农杆菌,农杆菌介导方法转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织,潮霉素筛选和PCR鉴定转基因植株。成功构建了重组植物表达质粒pSUE2,并将pSUE2转入农杆菌EHA105,潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因和TaNADP-ME2基因PCR鉴定获得16棵转基因阳性水稻植株。为进一步确定TaNADP-ME2基因的水分利用效率功能奠定了基础。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
汪阳东 李春秀 齐力旺 张守攻
以我国重要的生物能源灌木——中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据GenBank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到基因片段。在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957393)所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gmfad2-2a同源性高达88%,位于fad2基因编码区中部。将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建了反义表达载体pBI121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和氨苄青霉素的再生烟草植株。初步分析结果表明:与对照烟草相比,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少10.3%...
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