为探究副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起猪渗出性炎症的过程中血管内皮屏障的变化情况，以HPS感染原代猪血管内皮细胞，通过Western blot和荧光定量PCR检测HPS对Wnt/β-catenin通路及其下游靶基因表达的影响，并通过间接免疫荧光和跨内皮电阻测定检测细胞间粘附连接结构的改变。结果显示：HPS感染激活猪内皮细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，促使胞质中的β-catenin蛋白发生核转位，导致胞膜处由β-catenin和血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）构成的粘附连接结构被破坏，细胞通透性增加。抑制Wnt/β-catenin通路下游血管内皮生长因子（VEGF）基因的表达，可以明显抑制β-catenin的核转位，显著恢复内皮细胞间β-catenin和VE-cadherin构成的粘附连接结构，恢复内皮细胞通透性。以上研究结果表明，HPS通过激活猪内皮细胞中Wnt/β-catenin通路，破坏细胞间粘附连接，增加内皮细胞通透性；同时，Wnt/β-catenin通路下游VEGF基因通过正反馈调节效应放大了HPS感染引起的Wnt/β-catenin信号通路的激活效应和细胞结构的损伤。

副猪嗜血杆菌可引起猪的格氏病,其不同毒力菌株分子水平上的差异还不清楚。从广东省不同地区猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1～H9),并对其16SrRNA基因进行鉴定和分析。经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定,所分离的9株细菌为阳性副猪嗜血杆菌,具有卫星现象和不溶血特征。用hhdA基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,所获得的hhdA基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165、HPS59的hhdA基因的同源性为98%～99%,获得的分离菌株hhdA基因的同源性为99.0%～99.9%,菌株H1(5型)、H2(5型)、H8(4型)、H9(12型)hhdA基因在遗传进化关系上处于同一进化分...

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1~H9),并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,...

副猪嗜血杆菌(HPS)是感染猪产生浆膜炎、关节炎、脑膜炎的病原菌,为明确辽宁省副猪嗜血杆菌tbp A基因的保守性、遗传变异情况以及功能,以复苏培养后的菌株为研究对象,利用细菌学常规技术和PCR方法对HPS及其血清型进行验证,将目的基因连接于T5载体上,并转化到大肠杆菌感受态细胞中,获得克隆质粒,对不同血清型该基因序列进行PCR鉴定。通过NCBI网站中BLAST进行序列比对,并且运用DNA star软件进行核苷酸同源性分析和遗传变异规律分析。通过在线软件对tbp A编码蛋白的氨基酸组成、分子量、等电点、亲疏水性以及二级结构等进行分析。结果表明:从保存菌的HPS中成功复苏了4型、5型、9型和14型菌株;经PCR扩增这4种血清型HPS的tbp A基因长度均为2700bp;tbp A基因与参考菌株核苷酸同源性范围为86.5%~97.9%,4型和5型tbp A基因与84~(-1)5995、84~(-1)7975、H425亲缘性较近,9型tbp A基因与SW124和174亲缘性较近;14型tbp A基因与NO.4亲缘性较近;4种血清型tbp A基因与瑞典菌株D74在两个不同分支上,具有较远的亲缘关系。4种血清型tbp A基因编码蛋白分别有874,871,918,915个氨基酸组成;等电点分别为9.51,9.30,8.65,8.76;该蛋白属于亲水性蛋白;该蛋白的二级结构主要由α螺旋、无规则卷曲和伸展链构成。tbp A基因与美国株84~(-1)5995(KT588784.1)、德国株H425(KT588778.1)、日本株NO.4(KT588774.1)同源性相对较高,亲缘关系较近,但是也存在一定的差异性,该结果可为建立HPS最新基因突变跟踪提供参考依据;同时,通过对tbp A蛋白进行生物学信息分析,为进一步研究tbp A基因的功能奠定了分子基础。

　从全国十多个省市送检的疑似患多发浆膜炎与关节炎猪的病料中分离到 32株细菌,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性鉴定;根据副猪嗜血杆菌 16SrRNA序列设计引物进行PCR扩增, 将 822bp扩增片段连入T 载体后测序, 再与GenBank(M75065 )中的序列进行比对,表明其与国外副猪嗜血杆菌菌株 16SrRNA序列的同源性为 97%以上,确定为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, Hps)。将其中的 15株按Kieletein Rapp Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法进行血清型鉴定,结果为血清 5型 3株、血清 4型 4株、血清 13型2株、...

本文对副猪嗜血杆菌血清5型生长曲线进行了研究。结果表明:种子液接种后6 h开始进入对数生长期,培养24 h后活菌数达到最高峰,20～30 h活菌数维持在同一个水平,进入稳定期,30 h后活菌数呈现下降趋势,进入衰退期。该曲线提供了副猪嗜血杆菌生长规律,为疫苗研制提供了理论基础。

【目的】建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。【方法】根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测。优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR GreenⅠ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性。用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测。从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测。【结果】建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP...

【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与...

为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，以副猪嗜血杆菌外膜蛋白Ｐ５的特异性单克隆抗体１Ｅ２作为捕获抗体，兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体，通过方阵滴定优化夹心ＥＬＩＳＡ检测方法最佳反应条件，并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示，该检测方法中单克隆抗体１Ｅ２最佳包被浓度为３．４３４μｇ／ｍ Ｌ，兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为３．３５０μｇ／ｍ Ｌ，用１０ ｍｇ／ｍ Ｌ明胶３７℃封闭１ ｈ优于其他封闭液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为１∶４ ０００。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出１５个血清型的副猪嗜血杆菌病．．．

采用人脐静脉内皮细胞株ECV304体外培养的方法,复制过氧化氢(H2O2终浓度为50μg/ml)诱导的血管内皮细胞氧化损伤模型,应用硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)的含量,采用化学比色法分别检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、总一氧化氮合酶(T-NOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。结果显示,与正常对照组相比,过氧化氢损伤的血管内皮细胞其GSH-PX活性、T-AOC、NO含量及T-NOS活性均明显降低(P<0.01),iNOS活性明显增加(P

副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum,HPG)是鸡传染性鼻炎的病原菌。近年来,北京、陕西、四川等地证明了该病的发生。为了了解该病在山东省的流行状况,从山东德州地区5个鸡场的20只疑似鸡传染性鼻炎鸡体内共分离到6株细菌,经细菌分离培养、生化试验、鸡胚接种试验和16s rDNA基因序列分析等方法鉴定为副鸡嗜血杆菌。并经玻片凝集试验、Dot-ELISA、血凝试验分型研究,证实6株分离菌株均为副猪嗜血杆菌A型。从而为以后鸡传染性鼻炎的免疫治疗提供理论依据。

【目的】开展了泰地罗新注射液的体外抗菌活性及对仔猪感染副猪嗜血杆菌的保护作用研究。【方法】体外抑菌活性中,采用试管二倍稀释法,以泰拉霉素为对照,测定泰地罗新对副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌的最小抑菌浓度(MIC);在对仔猪感染副猪嗜血杆菌的保护作用中,选择菌量为1×10~(10) CFU·mL~(-1)的副猪嗜血杆菌细菌悬液0.5 mL·kg~(-1)bw作为攻毒剂量,进行腹腔注射,复制病理模型。将泰地罗新以2、4、8 mg·kg~(-1)bw 3个剂量,泰拉霉2.5 mg·kg~(-1)bw单次肌肉注射,治疗人工感染副猪嗜血杆菌的仔猪;在病死猪病料病原菌分离与鉴定中,挑取分离纯化后的副猪嗜血杆菌菌落进行基因组DNA提取,针对副猪嗜血杆菌16sRNA序列设计1对特异性引物,PCR扩增后检验目的 DNA片段碱基序列长度。【结果】体外抑菌结果显示,泰地罗新注射液对副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌及多杀性巴氏杆菌的MIC分别为0.06—8.00、0.06—8.00、0.25—1.00、2.00—32.00μg·mL~(-1),MIC50分别为0.5、2.0、4.0、0.5μg·mL~(-1),MIC90为2、8、16、1μg·mL~(-1),结果表明,泰地罗新注射液对副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌抑菌效果较强,对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌抑菌效果较弱;DNA目标片段PCR扩增结果显示,PCR扩增目标片段长度均与文献报道中预测条带一致,特异性片段长度为820bp左右,结果表明,病死猪只均死于副猪嗜血杆菌感染;体内治疗试验结果显示,泰地罗新注射液低、中、高剂量组增重分别为(2.5±0.2)、(2.9±0.2)、(2.9±0.3)kg,死亡率分别为40%、0、0,有效率分别为40%、100%、100%,治愈率分别为40%、100%、100%;泰拉霉素注射液组增重为(3.0±0.2)kg,死亡率为10%,有效率为90%,治愈率为80%;感染不给药组增重为(2.1±0.1)kg,死亡率为70%。结果表明,泰地罗新注射液高、中剂量组与泰拉霉素对照药物组无显著性差异(P>0.05),均能迅速的减轻临床症状,具有显著的治疗效果。泰地罗新低剂量组治疗效果与感染不给药组相当,无显著性差异(P>0.05)。【结论】泰地罗新注射液按4 mg·kg~(-1)bw临床推荐给药剂量,可有效治疗由副猪嗜血杆菌感染引起的猪呼吸道疾病。

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血

副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis)是规模化猪场的重要细菌性疾病之一。对已发表的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子量大约为41 kDa,利用基因工程的方法将该基因片段定向克隆至表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达后的分子量约为67 kDa。该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。

在沈阳某规模化养猪场疑似感染副猪嗜血杆菌的病猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性多形态杆菌，根据培养特性、生化试验结果、副猪嗜血杆菌１６ｓ ｒ ｒＮＡ的ＰＣｒ检测以及对ＰＣｒ产物进行测序，测序结果比对显示该分离株与ＧｅＮ ＢＡＮｋ中的ＨＰｓ同源性为９９％，因此将分离菌株鉴定为副猪嗜血杆菌。抗生素药物敏感试验结果表明：分离株对羧苄西林、氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢哌酮药物较敏感；对卡那霉素、复方新诺明、头孢他啶、四环素耐药。１６ｓ ｒ ｒＮＡ遗传进化关系显示：分离株与副猪嗜血杆菌２株血清５型的１６ｓ ｒ ｒＮＡ序列位于一个分支上，遗传进化关系比较相近，核苷酸同源性在９７．４％～１００％之间，可初步．．．