【目的】探讨含有WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)在平滑肌细胞分化过程中的表达情况及其作用机制。【方法】用实时定量PCR,检测WWP1在人、小鼠主动脉血管平滑肌细胞中以及小鼠胚胎干细胞向平滑肌细胞体外分化过程中表达量的变化情况。用萤光素酶活性试验及免疫共沉淀试验检测WWP1与Myocardin的结合情况。【结果】WWP1在人和小鼠的血管平滑肌细胞中高表达,在全反式维甲酸诱导小鼠胚胎干细胞向平滑肌细胞分化过程中的表达水平明显上调。WWP1能与Myocardin蛋白结合,WWP1的表达水平受Myocardin调控。【结论】WWP1很可能通过与Myocardin结合参与血管平滑肌细胞分化的...

【目的】研究家兔子宫平滑肌层细胞的体外培养和扩增方法。【方法】应用酶解消化法对新西兰大白兔的子宫平滑肌细胞进行体外分离和培养,并研究不同水平性腺激素对其生长的影响。【结果】酶解消化法可成功进行家兔子宫平滑肌细胞的体外培养和传代。子宫平滑肌细胞在体外的增殖受卵巢性腺激素的影响,100nmol/L雌二醇对其体外增殖有促进作用,而100nmol/L孕酮则有抑制作用。免疫组织化学结果表明,体外培养的子宫平滑肌细胞在激素作用下仍可维持其特性,在体外可传9~10代。【结论】建立了家兔子宫平滑肌细胞的体外培养和扩增方法,可为构建子宫三维结构提供充足的种子细胞。

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈...

探索简单快速实用的鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞培养方法:在严格无菌条件下对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞分离培养,待细胞融合度达约80%时进行传代,得到的内皮细胞利用差速消化法纯化,并观察2种细胞形态特征及培养特性,待细胞稳定生长后,采用荧光免疫组化技术鉴定细胞,并进行冻存和复苏,观察复苏后细胞活性。结果显示:24 h后组织块周围即有少量细胞爬出,内皮细胞大量生长后呈突起状排列,立体感强,平滑肌细胞在培养后的第5天呈现"峰谷"样外观,经免疫荧光法证明是内皮细胞和平滑肌细胞的纯培养,冻存于液氮中1~2个月复苏后细胞的活性都较好,可以恢复旺盛生长。结论:本研究提出的组织贴块法能成功获得内皮细胞和平滑...

应用组织贴块法、贴块配合差速贴壁法成功培养不同日龄鸡的肺动脉平滑肌细胞。一般需 4～ 7d细胞从组织块边缘长出 ,再经 5～ 1 0 d长成细胞单层。鸡日龄越小培养的肺动脉平滑肌细胞生长越旺盛。培养的肺动脉平滑肌细胞呈梭形、三角形 ,圆形核位于中央 ,胞浆丰富致密。用兔抗鸡α- actin多克隆抗体为一抗做免疫组化染色 ,平滑肌细胞占 95%以上

为探索内皮素-1(ET-1)对肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)体外增殖的影响及其发挥效应的受体途径,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察ET-1对PASMC体外增殖的刺激作用,并分别观察内皮素A受体(ETAR)拮抗剂BQ123和B受体(ETBR)拮抗剂BQ788对ET-1作用下的肉鸡PASMC增殖的影响。结果表明:ET-1可显著刺激肉鸡PASMC的增殖(P0.05)。结论:ET-1具有促肉鸡PASMC增殖的作用,此作用受ETAR介导。

采用酶消化法原代培养大鼠肠平滑肌细胞,用倒置相差显微镜测定血根碱对大鼠肠平滑肌细胞收缩的影响。结果表明:酶消化法原代培养的大鼠肠平滑肌细胞纯度高(α–actin检测阳性率达90%以上),密度大,并呈现平滑肌细胞特有的"峰–谷"样排列;血根碱及阿托品可显著抑制肠平滑肌细胞收缩,抑制率分别为32.22%和34.99%;血根碱和阿托品联用对肠平滑肌细胞收缩的抑制率可达68.8%,与单独使用血根碱或阿托品的抑制率差异显著;血根碱对乙酰胆碱、组胺及KCl诱导的肠平滑肌细胞的收缩具有显著的抑制作用;血根碱主要通过作用于细胞膜上的M受体、H1受体和钙离子通道来实现对大鼠肠平滑肌细胞收缩的抑制作用。

【目的】探讨肉鸡肺小动脉中膜5-羟色胺(5-HT)含量与肺小动脉平滑肌细胞增殖的关系,明确5-羟色胺转运体(5-HTT)是否参与了肉鸡肺动脉高压的发生。【方法】20日龄科宝肉鸡分成非诱病组(静脉注射生理盐水,包括空白对照组、氟西汀、西酞普兰组,30只/组)和诱病组(静脉注射纤维素微粒,包括药物空白对照组、氟西汀组、西酞普兰组,50只/组)。自21d起,记录肺动脉高压综合征(PHS)发病率,并分别于21、28、35、42d从各组随机抽样,测定右心室/全心室重量比(RV/TV),采用免疫组织化学技术、增殖细胞核抗原(PCNA)染色和核仁组织区嗜银蛋白(AgNOR)染色方法检测肺小动脉中膜5-HT量...

【目的】建立稳定成熟的牛成肌细胞胰岛素诱导成脂分化体系,为肉牛肉脂品质的改良提供参考。【方法】取1日龄荷斯坦公牛犊后腿肌肉,用Ⅳ型胶原酶消化法分离成肌细胞,用胰岛素诱导成肌细胞成脂分化,以未添加胰岛素的培养基为对照组,检测成肌细胞成脂分化过程中细胞形态的变化,并分析与成肌细胞和脂肪细胞分化相关基因(C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ、Myf5、MyoD)分别诱导第3,6,9,12,15天相对表达量的变化,分析牛成肌细胞的诱导分化情况。【结果】成功分离培养了牛原代成肌细胞。胰岛素处理组细胞中脂滴的油红O染色明显,C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ和MyoD相对表达量明显增高...

【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分，其生长发育直接影响畜禽肉产量，叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子，其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用，为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品，提取其RNA并反转录，利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞，通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒，以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达，其在成年牛的背脂中表达量最高，在背最长肌组织中表达量最低，且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的（P<0.01）。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达，其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体，并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁，在感染牛骨骼肌细胞后，能显著提高FoxO1表达水平（P<0.01）。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率（P<0.01），流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数，抑制细胞G1/S期的转化，并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现，增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调（P<0.01），促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调（P<0.05）。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少，qPCR检测结果发现，骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调（P<0.05）。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达，是一个广泛存在的转录调控因子，并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异，起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用，特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达，从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化，并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。

【背景】肌肉可以维持哺乳动物运动功能并调节机体代谢,它的数量和分布对肉质有重要影响,骨骼肌的生长发育及其遗传特性在很大程度上影响甚至决定家畜的产肉量和肉品质,研究骨骼肌的生长发育具有重要意义。TP53INP2对自噬的调控作用以及对前体脂肪细胞分化的调控机制已有研究,而对于牛成肌细胞分化的影响尚未报道。【目的】探究TP53INP2对秦川牛成肌细胞分化的影响,为肉牛肉用性状分子育种工作提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测了TP53INP2在24月龄秦川牛不同组织中的表达特性,同时分析了其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达规律;合成TP53INP2基因siRNA并转染秦川牛成肌细胞,转染后12h进行诱导分化,观察成肌细胞表型变化,并利用RT-qPCR技术和Western Blot技术分别检测其在诱导分化第四天时分化标志基因和蛋白的表达情况。【结果】1.RT-qPCR结果显示,TP53INP2在成年秦川牛背最长肌组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低。TP53INP2在成年牛心脏、肝脏、肾脏、网胃、瘤胃中表达量较高,在其余组织中表达量较低(与背最长肌相比)。2.随着成肌细胞的分化,该基因在第0—4天表达量呈上升趋势且在第4天达到峰值,随后表达量呈下降趋势。3.在成肌细胞中干扰TP53INP2后,试验组肌管的数量和长度均显著低于对照组。4.干扰TP53INP2并提取细胞总RNA,RT-qPCR结果显示,成肌细胞分化标志基因肌细胞生成素(MYOG)和肌球重链蛋白3(MYH3)相对于对照组表达量显著降低。5.干扰TP53INP2并提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示,试验组MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表达量均降低且与对照组相比差异极显著。【结论】干扰TP53INP2对牛成肌细胞的分化具有抑制作用,提示该基因可能对秦川牛肌肉组织的生长发育具有重要的调控作用,可对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。

旨在克隆山羊FGF9基因序列并对其进行生物信息学分析,阐明FGF9基因组织表达特性及其在成肌细胞分化过程中的表达差异。试验动物为简州大耳羊,利用RT-PCR技术克隆FGF9基因序列,再用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测FGF9在山羊各组织中的表达特性及其在成肌细胞不同分化阶段的表达情况。结果显示,克隆得到山羊FGF9基因序列818 bp,其中ORF区627 bp,编码208个氨基酸,其CDS区核苷酸序列与牛和绵羊有99%的同源性。FGF9蛋白具有1个跨膜结构域和1个FGF家族同源性结构域,为不稳定亲水蛋白。FGF9基因在山羊各组织中均有表达,在肾脏中表达水平最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。FGF9基因在诱导分化第2天表达水平显著高于分化前(P<0.05),且在第4天达到极显著水平(P<0.01)。推测其可作为调控山羊成肌细胞分化的候选基因。为进一步探究FGF9基因在山羊肌肉生长中的作用提供理论依据。

旨在探究bta-miR-133a参与肉牛调控背最长肌发育的分子机制。通过采集布莱凯特黑牛和鲁西黄牛的背最长肌进行sRNA建库,数据筛选与肉牛骨骼肌发育相关的bta-miR-133a,采用生物信息学分析软件鉴定其保守性并预测其靶基因,对其靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证;选取C2C12细胞进行功能验证,过表达和敲除bta-miR-133a, 48 h后2%马血清诱导观察肌管分化过程,CCK-8检测细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测细胞增殖分化标记基因PCNA、CCND1、Myh1、Myod1以及靶基因的表达量。结果表明,bta-miR-133a的成熟序列在各物种间高度保守,靶基因预测为PAX7,经双荧光素酶报告试验验证,bta-miR-133a与PAX7存在靶标关系。GO富集和KEGG通路分析结果显示,预测靶基因显著富集于肌动蛋白细胞骨架组织的调节、经典Wnt信号通路的负调控、肌动蛋白丝结合等GO条目中和MAPK、Ras、FoxO等与肌肉发育相关的信号通路中。过表达bta-miR-133a促进肌管分化(P<0.01),抑制靶基因PAX7的表达(P<0.01);敲除bta-miR-133a则抑制肌管分化(P<0.05),促进靶基因PAX7表达(P<0.01)。在细胞增殖方面,过表达bta-miR-133a降低其标记基因PCNA、CCND1的表达量(P<0.05),敲除组则相反;在细胞分化方面,过表达bta-miR-133a增加其标记基因Myh1、Myod1的表达量(P<0.01),敲除组则相反。综上表明,bta-miR-133a可能通过靶向负调控PAX7的表达抑制成肌细胞增殖、促进其分化而参与背最长肌的发育过程。

为了确定MSTN RNAi双元表达载体pEGFP-N1-M1-M2对成肌细胞增殖和分化的影响,利用脂质体介导法将该双元表达载体转染成肌细胞,MTT法检测MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖的作用,Giemsa染色检测pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体对成肌细胞融合率的影响。试验结果表明,pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体有促进成肌细胞增殖和分化的作用,能够促进成肌细胞大量融合。该结果为进一步探讨MSTN基因的作用机理提供了更为便捷的研究方法。

【目的】克隆绵羊IGF-1基因CDS区,构建绵羊IGF-1基因慢病毒表达载体,分析IGF-1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA,通过RT-PCR方法获得IGF-1全长CDS序列,经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接,构建pLEX-IGF-1慢病毒重组表达质粒,并在293T细胞中进行病毒包装和生产。分离培养绵羊原代成肌细胞,并用重组慢病毒使其感染,建立稳定转染pLEX-IGF-1的绵羊成肌细胞系。通过绘制细胞生长曲线,分析过表达IGF-1对绵羊成肌细胞生长的影响;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。【结果】克隆获得长518bp的IGF-1CDS区序列。成功构建...