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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
仇知光 刘庆慧 黄倢
选用对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)囊膜蛋白VP37的功能区段,利用大肠杆菌密码子偏爱性,在氨基酸不变的情况下将VP37中的密码子通过人工合成改为大肠杆菌偏爱型密码子,并克隆至表达载体pBAD/gIIIA中,构成重组载体pBAD/gIIIA-VP37p′。将重组载体转化入大肠杆菌Top10中,在相同条件下用L-阿拉伯糖与未优化的重组菌株Top10-pBAD/gIIIA-VP37p一同诱导。结果显示,与野生型基因VP37p相比,经密码子优化的VP37p′基因表达目的蛋白量占总蛋白的40.5%,明显高于野生型6.5%的目的蛋白表达量。
关键词：
偏爱密码子 VP37 大肠杆菌 表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄冬艳 杨兵 齐欣 陈小玲 徐福洲
根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a(+)载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。
关键词：
鸡贫血病毒 VP1基因 克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴方丽 金伟波 王保莉
为了得到具有生物学活性的人表皮生长因子(hEGF),将含有人表皮生长因子基因的原核表达载体pGEX-4t-1(+)-hEGF转化入BL21-CodonPlusTM-RP表达宿主菌进行大量表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。收集包涵体,用氧化复性的方法,加入还原型的谷胱甘肽进行复性,之后通过GlutathioneSepharoseTM4B纯化柱,分离纯化得到复性的融合蛋白。以兔抗人EGF单克隆抗体为一抗,进行Western blotting鉴定,证明分离纯化得到的融合蛋白含有目的蛋白hEGF。最后对复性的融合蛋白进行了活性分析,表明该融合蛋白具有良好的hEGF生物学活...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
于寒颖 杨谦
不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序.该基因编码五功能的AROM蛋白.为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS),将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶(DHQS)和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E,并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中表达.酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX...
关键词：
基因表达 核盘菌 arom基因 大肠杆菌
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王慈 曹敏杰 郑晓江 詹春兰 刘光明 蔡秋凤
以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和P...
关键词：
鲢 小清蛋白 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。
关键词：
β2微球蛋白 重组蛋白 包涵体 复性
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
曹晓风 赵武玲 吴玮 阎隆飞
高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中
关键词：
肌动蛋白 基因表达 包涵体
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈韬
通过定点突变生成的方法,分别构建了全长artemincDNA和2个C末端缺失突变体Ar-CΔ19和Ar-CΔ35,以及2个单点替代突变体Ar-C22和Ar-C61,并在大肠杆菌BL21PRO中得到表达,重组蛋白的表达水平约占细胞总蛋白的2%~3%.电镜检测结果表明,重组artemin寡聚体呈规则的花环状,直径为18nm左右,大于铁蛋白重链的寡聚体(12nm)和来自于休眠卵的artemin寡聚体(16nm),2个C末端的缺失突变对artemin的寡聚化没有明显影响,而单点替代突变Ar-C22对寡聚化影响较小,Ar-C61则完全不能寡聚化,说明Cys61对于维持artemin的空间构象有着重要的作...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张守涛 史婧 李楠 郭蔼光
根据蛇毒纤溶酶(A lfim eprase,ALF)氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,设计了14条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法人工合成了ALF基因编码区。通过克隆使其分别连接在融合标签N usA,T h ioredox-in,Skp,H is T ag和信号肽pe lB的C端,构建成了多种ALF表达载体p43-A lf,p25-A lf,p32-A lf,p15-A lf和pSkp-A lf,转化大肠杆菌后进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDD-PAGE分析。实验结果表明,合成的ALF基因长度为603 bp;构建的表达载体在大肠杆菌中均获得了很好的表达,其中pSkp-A lf表达量最高...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
王保明 谭晓风
利用构建的油茶近成熟种子cDNA文库,分离鉴定了一条油茶亲环素基因的cDNA序列;该序列全长975bp(base pair),含有一个621bp的开放码框,编码207个氨基酸,将其命名为co-cyp(GenBank登录号:FJ377540)。该基因与其它物种的亲环素基因具有较高的同源性,结构分析表明该蛋白的二级结构以片层为主,并伴有α-螺旋、β转角和大量的无规则卷曲;其N端有一个强疏水性的信号肽序列,具有跨膜结构和较好的柔性;还具有N-连接糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-连接肉豆蔻酰位点、脯氨酸顺反异构酶标志序列、环孢菌素(CsA)结合位点(...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
白俊杰 叶星 李新辉 简清 罗建仁
用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄炜 余瑛 鲁秀敏 方佳佳 蒋丽
为了建立小鼠FGF9的原核表达体系,获得纯化的FGF9重组蛋白,采用PCR技术扩增FGF9,并将其克隆入原核表达载体pET30a(+)中,经测序验证后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,采用亲和层析技术进行目的蛋白的纯化,并用Western blotting进行了免疫原性验证。测序结果显示插入到载体中的片段与FGF9的天然序列一致,在BL21(DE3)中表达出了可溶性的FGF9重组蛋白,其表达量达到总蛋白的40%;用镍螯合亲和层析方法获得了纯度大于95%的FGF9重组蛋白。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱春平 李燕 吴亚丽 常婧竹 刘琳 高文明 李新生
【目的】克隆和表达H3N2型猪流感病毒(SIV)A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因,为制备NP抗体和SIV基因工程疫苗奠定基础。【方法】提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA,用RT-PCR扩增NP基因,将其定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体,构建重组表达载体,并将其转化入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,同时考察IPTG不同浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和不同诱导时间(2,4,6,8h)对重组NP蛋白表达量的影响。【结果】克...
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