[目的]本研究旨在明确WNT6基因在蛋鸡卵泡发育过程中的生物学功能，并对其作用机制进行初步探究。[方法]本研究以300d海兰蛋鸡为研究对象，首先检测了WNT6 mRNA在不同组织中表达特征；同时对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞进行敲减和过表达WNT6基因后，经CCK8检测细胞增殖和ELISA检测细胞培养基中的孕酮（P4）含量，以及荧光定量PCR检测卵泡刺激素受体（FSHR）和StAR、CYP11A1等基因表达量；另外，设立卵泡刺激素（FSH）浓度梯度处理体外培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞，研究FSH对WNT6和WNT通路相关基因表达量的影响。[结果]结果显示，WNT6 mRNA在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异表达，且在处于卵泡选择关键时期的小黄卵泡颗粒细胞内具有最高表达水平；与对照组相比，过表达WNT6极显著促进颗粒细胞增殖（P＜0.01），极显著提高了颗粒细胞P4合成量（P＜0.01），并显著提高FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达量（P＜0.05）；与之相反，敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制（P＜0.01），P4合成量极显著显著减少（P＜0.01），并显著降低FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达量（P＜0.05）；与此同时，本研究还发现，FSH呈剂量依赖性促进WNT6基因表达（P＜0.05），FSH还可显著提高颗粒细胞LRP1基因表达量（P＜0.05）并极显著降低FOXO1基因表达量（P＜0.01）。[结论] WNT6在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异性表达，且其表达水平受FSH调控，WNT6促进颗粒细胞增殖与类固醇激素合成，并提高颗粒细胞FSHR基因表达表达水平。本研究结果提示，WNT6协同FSH促进蛋鸡卵泡发育并调控蛋鸡卵泡选择

[目的]本试验旨在研究卵泡抑素（Follistatin， FST）基因对湖羊卵巢颗粒细胞（Granulosa Cells， GCs）增殖及凋亡的影响，为揭示FST基因对湖羊繁殖调控机理的影响提供理论基础。[方法]首先利用免疫组织化学方法检测FST在卵巢组织中的表达特征；然后利用EdU、qRT-PCR、WB、流式细胞等技术，分析FST基因过表达和干扰对湖羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响；最后通过RNA-seq分析FST基因干扰前后湖羊卵巢颗粒细胞的转录组表达差异变化。[结果]FST在湖羊卵巢颗粒细胞内高表达，干扰FST能抑制湖羊卵巢颗粒细胞增殖，降低细胞中PCNA基因的mRNA和蛋白水平，过表达FST则表现出相反的趋势；RNA-seq结果进一步显示干扰FST后颗粒细胞中细胞周期调控、卵母细胞减数分裂、孕激素分泌等相关功能及通路发生显著变化。[结论]FST可以促进湖羊GCs增殖，抑制GCs凋亡，影响卵母细胞分裂、生殖激素分泌相关基因的表达，进而参与湖羊卵泡发育进程。

选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞。采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96h,用流式细胞术检测Bcl2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF1的含量。结果发现,转染Bcl2重组质粒组的Bcl2蛋白表达量和IGF1分泌量均多于其他各组。分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF1分泌量减少,而F4的IGF1分泌量基本不变。结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡...

【目的】研究kisspeptin-10对无血清培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的作用及可能机制。【方法】选取200日龄处于产蛋高峰期的伊莎蛋鸡,于排卵前剖腹收集F1卵泡,分离纯化颗粒细胞,于含胎牛血清培养基中培养24 h,换成无血清培养基稳定培养24 h后,用不同浓度的Kp-10、U73122、EGTA等单独或共同处理细胞,收集细胞上清,放射免疫学方法检测培养基中孕酮含量。【结果】(1)通过免疫细胞化学方法,显示颗粒细胞上有Kp-10免疫活性样物质的阳性表达;(2)Kp-10处理可显著增加无血清培养的颗粒细胞的活力,100 nmol.L-1时可显著促进孕酮的分泌(P<0.05);(3)与对照组相比...

［目的］本试验旨在研究毛喉素（FSK）对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及其机制。［方法］体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞，预培养24 h。应用FSK（10 nmol·L~(-1)）处理细胞48 h，检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达；处理96 h检测孕酮（P_(4)）水平及类固醇合成相关蛋白的表达。［结果］与对照组相比，FSK改变了细胞形态，增大了细胞直径，并使细胞内脂滴含量增加（P < 0.01）；FSK降低了细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK降低了颗粒细胞标记基因促卵泡素受体（FSHR）mRNA的表达水平，提高了黄体细胞标记基因前列腺素受体（PTGFR）和促黄体素受体（LHCGR）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK促进了P_(4)分泌，提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平（P < 0.01）；从细胞周期看，FSK降低了细胞周期素B1（CCNB1）、细胞周期素D1（CCND1）和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）基因的表达（P < 0.01），而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B（P21~(cip1)/P27~(kip1)）基因表达上调（P < 0.01），并将细胞周期阻滞在G0/G1期。［结论］FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢、退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。

选用正在产蛋的罗曼鸡 ,取其排序第 3的卵泡分离颗粒层细胞 ,用含血清培养基培养 ,并用含脂质体每孔 0 0 ,0 6,1 2 ,2 4,4 8μL和 bcl 2基因重组质粒每孔 0 2 μg转染卵泡颗粒细胞。用流式细胞术等方法分析转基因后的原代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。结果发现 ,与未转染组相比 ,转染后的传代细胞分裂速度较快 (P

[目的]本试验旨在研究c-Myc在鸡卵泡上的表达及FSH对c-Myc的诱导作用，为明确c-Myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡（SWF）、大白卵泡（LWF）、小黄卵泡（SYF）、F4和F1卵泡颗粒层和膜层，检测c-Myc mRNA和蛋白的表达；应用FSH（50 ng/mL）处理小黄卵泡36 h，测量卵泡颗粒层的厚度和密度，检测颗粒层和膜层c-Myc、标记基因和周期相关基因表达；体外培养小黄卵泡颗粒细胞，敲减c-Myc 24 h后加入FSH（50 ng/mL）处理24 h，检测c-Myc 表达。[结果] c-Myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达量都显著高于排卵前卵泡，卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比，FSH增加了小黄卵泡颗粒层厚度约25.5%（P<0.05），密度约27.8%（P<0.01）。在小黄卵泡颗粒层上，FSH降低了c-Myc和类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）mRNA的表达水平（P<0.05），提高了细胞增殖抗原（PCNA）和周期蛋白D2（CCND2）mRNA的表达水平（P<0.05）。[结论]FSH能诱导c-Myc在鸡颗粒细胞中的表达，且猜测c-Myc与体外培养的鸡小黄卵泡颗粒细胞的终端分化有关。

【目的】卵泡发育是一个复杂的调控过程，其中绵羊卵泡颗粒细胞（granulosa cells, GCs）的增殖，分化会直接影响卵泡的发育状况。TGF-β信号通路在绵羊卵巢发育和卵泡生长过程中起着重要作用，Smad7作为TGF-β信号通路关键性的抑制基因也发挥重要作用，通过探究Smad7介导TGF-β信号通路对绵羊卵泡GCs增殖凋亡的影响，为进一步研究Smad7在卵泡GCs增殖凋亡过程中的调控作用提供依据。【方法】选取4—6月龄未怀孕的晋中健康杜湖杂交母羊20只，屠宰后采集双侧卵巢组织，分离培养卵泡颗粒细胞，FSHR细胞免疫荧光鉴定，Smad7细胞免疫荧光的表达定位，CCK8法测定细胞增殖情况，绘制生长曲线；细胞传代后外源添加不同浓度Smad7激动剂积雪草苷（asiaticoside,AS）(0、100、200、400、600 ng·mL-1)培养绵羊卵泡GCs，选择AS最佳作用浓度处理二代颗粒细胞，采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平；合成3个siSmad7，转染至卵泡GCs中，选择干扰效果最佳的，采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平。【结果】Smad7在绵羊卵泡GCs中有表达；200 ng·mL-1 AS能极显著上调Smad7在GCs的表达（P <0.01）,siSmad7-1对绵羊卵泡GCs的转染效果最佳（P<0.01）;Smad7上调能显著增加TGF-β信号通路Smad4,TFDP-1和EP300的表达量（P<0.05），极显著增加TGF-β信号通路SP1的表达（P<0.01），显著增加凋亡相关基因Caspase8的表达量（P<0.05），极显著增加凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量（P<0.01），显著升高细胞周期相关基因P21和P27的表达量（P<0.05），极显著升高细胞周期相关基因CCND2的表达量（P<0.01），而CCND1的表达量显著降低（P<0.05），极显著降低TGF-β信号通路SP1的表达量（P<0.01），显著降低凋亡相关基因Caspase8的表达量（P<0.05），极显著降低凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量（P<0.01），极显著降低细胞周期相关基因P21,P27和CCND2的表达量（P<0.01），极显著升高CCND1的表达量（P<0.01）。【结论】Smad7介导TGF-β信号通路抑制绵羊卵泡GCs增殖和促进细胞凋亡。

通过在卵母细胞体外成熟过程中添加不同浓度的卵丘细胞或其外围壁层颗粒细胞进行共培养,对山羊卵母细胞成熟过程中卵泡颗粒细胞对卵母细胞减数分裂抑制作用及作用机制进行了探索。结果表明,成熟液中添加105和106个/mL卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞的卵母细胞体外成熟率与对照组相比差异不显著(p>0.05),但添加5×106个/mL(41.2%)和107个/mL(24.6%)卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞组的成熟率显著降低(p

【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,>1.5~≤3.0mm,>3.0~≤5.0mm,>5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最...

【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因－苯丙胺调节转录肽（ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ｃａｒｔ）的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组ｏｄＦ１（ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏＦ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）和ｏｄＦ２（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｌａｒｇｅｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏＦ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）颗粒细胞（ｇｒａｎｕｌｅｓａ ｃｅｌｌｓ，ｇｃｓ）构建ｒｎａ文库，ｉｌｌｕｍｉｎａ ｈｉ ｓｅｑ ２０００平台测序；采集屠宰牛双侧卵巢，通过黄体形态特征筛选处于第一卵泡波阶段的最大卵泡和第二．．．

【目的】研究体外培养牛卵巢颗粒细胞中Sprouty基因(Spry)的表达,探讨成纤维细胞生长因子1(FGF1)对Spry基因表达的影响。【方法】从屠宰场收集牛卵巢,剪下直径2~5 mm的卵泡,机械破碎卵泡后收集颗粒细胞进行体外培养,在培养的第5天用FGF1和PD98059处理培养的颗粒细胞,然后用Trizol提取细胞总RNA,利用牛特异性引物进行实时定量PCR检测,用ΔΔCt方法计算Spry基因的相对表达量。【结果】牛卵巢颗粒细胞可以表达Spry基因;Spry基因的表达与FGF1呈现剂量依赖关系,Spry2和Spry4的表达量随FGF1作用时间的延长呈现出先上升后下降的变化趋势;FGF1信号通...

【背景】蛋鸭卵泡发育是决定其产蛋性能的关键因素。已有研究表明，禽类卵泡发育是极为复杂的生物学过程，目前人们已对家禽的卵泡发育模式有了一定的了解，但作为决定产蛋量的重要因素，卵泡发育的具体调控机理仍需进一步深入研究。颗粒细胞是卵泡中主要的功能细胞，可调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，同时也精确的调控卵泡的生长发育，维持卵巢的正常功能（诱导排卵、维持成熟分裂的阻断、为卵母细胞提供底物等）。circRNA是一类新型的内源性非编码RNA，在卵泡发育中发挥重要的调控作用。【目的】通过构建circRNA过表达载体上调circ-13267的表达，研究circ-13267在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的作用及其调控机制，为蛋鸭卵泡发育的调控机制解析提供依据。【方法】首先，利用Q-PCR检测蛋鸭卵泡颗粒细胞的细胞质与细胞核中circ-13267的表达水平；构建circ-13267的过表达载体circ-13267-pLCDH，在蛋鸭颗粒细胞中过表达circ-13267后，利用Q-PCR法检测circ-13267、let-7-19、ERBB4、FAS和BCL2的表达水平；分别转染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR于蛋鸭卵泡颗粒细胞，24 h后利用EdU法检测蛋鸭卵泡颗粒细胞的增殖能力；将circ-13267的线性序列或ERBB4的3′UTR克隆到pmirGLo载体中，同时对上述野生型序列中的let-7-19结合位点进行突变，得到表达突变型序列的载体，利用双荧光素酶报告基因验证circ-13267与let-7-19及let-7-19与靶基因ERBB4的结合关系；在蛋鸭卵泡颗粒细胞中转染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR，利用流式细胞术和Annexin V-FITC检测蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡情况。【结果】环状RNA circ-13267在细胞质和细胞核中均有表达；双荧光素酶报告基因试验结果显示，let-7-19能与ERBB4结合，进而下调荧光素酶的活性，当ERBB4序列中let-7-19的结合位点突变后，let-7-19则无法抑制荧光素酶的表达，说明ERBB4是let-7-19的一个靶基因；荧光定量检测结果显示，过表达环状RNAcirc-13267后BCL2基因的表达显著降低（P<0.05），而FAS和ERBB4基因的表达量显著升高（P<0.05），当过表达let-7-19后，ERBB4基因的表达量显著升高（P<0.05），而抑制let-7-19后ERBB4基因的表达量显著降低（P0.05），而与过表达circ-13267组相比，共转组中BCL2基因的表达量极显著降低（P<0.01）、FAS的表达量极显著升高（P<0.01），说明circ-13267促进蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡的作用被抑制；利用流式细胞仪检测转染后的蛋鸭卵泡颗粒细胞发现，与共转染circ-13267和let-7-19组相比，仅过表达circ-13267后，晚期凋亡细胞数和总凋亡细胞数均显著增加（P<0.05），而活细胞数显著降低（P<0.05）。【结论】蛋鸭circ-13267在蛋鸭卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中均有表达，circ-13267可以吸附let-7-19并靶向ERBB4基因，从而促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡，为解析蛋鸭卵泡发育的调控机制提供理论依据。

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L(-1))、中(10-7mol·L(-1))、高(10-6mol·L(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各

[目的]本研究旨在分析猪卵泡发育不同阶段颗粒细胞中内参基因的表达稳定性，筛选有效内参基因用于鉴定猪卵泡发育关键调控基因及其表达模式。[方法]基于形态学观察与类固醇激素检测分离猪腔前、有腔、成熟和闭锁卵泡，同时收集相应颗粒细胞；利用RT-qPCR检测甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（ACTB）、ATP合酶F1（ATP5F1）、β2-微球蛋白（B2M）、真核翻译伸长因子1α（EEF1A1）、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）、核糖体蛋白S3（RPS3）、微管蛋白α-1b（TUBA1B）和泛素C（UBC）等9个候选内参基因在猪卵泡不同发育阶段颗粒细胞中的表达水平；综合△Ct、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等算法分析候选内参基因在猪卵泡发育过程中的表达稳定性。[结果]研究发现候选内参基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达水平存在较大差异，其中EEF1A1和TUBA1B的表达水平较高，而HPRT1和UBC的表达水平较低；不同算法得到的稳定性存在差异，其中△Ct、NormFinder和BestKeeper分析发现RPS3和ATP5F1的稳定性较高，geNorm分析发现GAPDH和HPRT1的稳定性较高，最终利用RefFinder进行综合权重分析指出候选内参基因的稳定性高低排序如下：RPS3、ATP5F1、HPRT1、EEF1A1、GAPDH、ACTB、TUBA1B、B2M、UBC；进一步以不同表达稳定性内参基因为参照对母猪繁殖力候选基因（FSHR和NORFA）在卵泡发育过程中的表达模式进行检测，结果表明内参基因稳定性对准确鉴定目的基因表达水平和变化模式至关重要。[结论] RPS3和ATP5F1在猪卵泡发育过程中具有较高的表达稳定性，可作为有效内参基因用于后续猪卵泡发育相关研究，同时为鉴定猪卵泡发育关键调控基因及其表达模式等相关研究内参基因的选择提供了理论依据。