[目的]鉴定葡萄miR396家族成员（VvmiR396s）及其靶基因VvGRF1，探究VvmiR396s-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396s及其靶基因，生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，RT-qPCR 检测VvmiR396s在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396s-VvGRF相关性差异。[结果]与‘魏可’葡萄相比，‘京可晶’葡萄花后28 d种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而前者种子正常发育。对VvmiR396a/b/c/d 的前体及其成熟体序列进行鉴定，VvmiR396a/b/c/d前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396a/b/c/d 与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396s的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1/10是VvmiR396s的真实靶基因，且后者对前两者的裂解位点及频度分别为10~(th)(19/22、5/25)/11~(th )(2/22、2/25)和9~(th)(17/21、3/20)/11~(th)(2/21、1/20)；进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行了活体验证，并发现VvmiR396s对VvGRF1的裂解作用强于VvGRF10，故在此重点研究其对VvGRF1的作用。靶基因VvGRF1蛋白与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近，且不同物种的GRF1均含有QLQ、WRC两个结构域；VvMIR396s和VvGRF1的启动子上都有多种激素（生长素、赤霉素、脱落酸等）响应元件，说明其可能通过响应激素信号从而调控生长发育；定量结果发现，在‘京可晶’种子败育过程中，VvmiR396a/b/c/d的表达量逐渐升高，且在败育关键期（花后42 d）有最高表达，而VvGRF1呈现相反表达模式；而在有核品种‘魏可’种子发育中，VvmiR396s呈现下降的趋势，在花后42 d有最低表达，靶基因表现相反的表达模式，表明VvmiR396s可能介导VvGRF1正调控葡萄种子败育，而负调控种子的发育；进一步相关性分析发现，‘京可晶’种子败育中VvmiR396b与VvGRF1的负相关性最高，表明VvmiR396b对VvGRF1具有最强的负调控作用，且VvmiR396b-VvGRF1可能是葡萄种子败育的主要调控模块。[结论]在假单性结实葡萄‘京可晶’中，鉴定到VvmiR396a/b/c/d 4个成员；VvmiR396b-VvGRF1可能是参与调控葡萄种胚败育的调控途径。

【目的】鉴定葡萄miR164s(VvmiR164a/b/c/d)及其靶基因，明确VvmiR164s及其靶基因应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的调控作用。【方法】以‘魏可’葡萄（Vitis vinifera L. Wink）为试材，利用miR-RACE、PCR、RLM-RACE与PPM-RACE、qRT-PCR及生物信息学等技术，分析VvmiR164s-VvNAC100模块应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的时空表达特征及其潜在功能。【结果】赤霉素在花前处理‘魏可’葡萄，可诱导其单性结实，导致葡萄的无核。克隆鉴定了VvmiR164a/b/c/d的精确序列，预测到其4条靶基因VvNAC100-1、VvNAC100-2、VvNAC098、VvNAC021，结合匹配程度与前期数据，在此重点分析靶基因VvNAC100-2，并将其命名为VvNAC100。克隆鉴定靶基因VvNAC100，验证其裂解位点，并对其开展蛋白进化、染色体定位及结构分析。VvNAC100裂解位点位于miRNA 5′端的第9位与第11位，裂解频度为17/20与11/20，定位于葡萄的Chr14上，编码363个氨基酸，含有一个NAM结构域，且其定位于细胞核。VvNAC100蛋白与其他物种氨基酸序列保守性较高，功能相似，其中与辣椒、烟草等物种亲缘关系较近。VvMIR164a/b/c/d的启动子与其靶基因VvNAC100的启动子均包含多种激素作用元件，表明其可能通过响应不同的激素来参与葡萄生长发育的调控。RT-qPCR结果显示，随着葡萄子房的发育，VvmiR164b的表达水平呈下降趋势，其靶基因VvNAC100在子房发育前期呈上升的表达趋势，具有一定的负相关，而VvmiR164a/c/d与VvNAC100表达模式相似，呈现一定的正相关；GA处理后，VvmiR164a/c/d在葡萄子房单性结实过程中的表达极显著地上升，进而也显著抑制了VvNAC100在这一时期的表达，从而促进了VvmiR164a/c/d-VvNAC100表达水平的负相关；但VvmiR164b在GA处理后表现出下降的趋势，且其与VvNAC100的表达水平呈现一定的正相关，表明GA处理增强了VvmiR164a/c/d对VvNAC100的负调控，减弱了VvmiR164b对VvNAC100的负调控作用。【结论】VvNAC100是VvmiR164家族VvmiR164a/b/c/d的真实靶基因；在葡萄单性结实过程中，赤霉素诱导了VvmiR164a/c/d对靶基因VvNAC100的负调控作用，抑制了VvmiR164b对靶基因VvNAC100的负调控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族参与赤霉素诱导葡萄单性结实的主效因子。

[目的]探究不同拉枝处理对葡萄冬芽成花过程中花发育相关基因表达的影响。[方法]试验以‘夏黑’葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Summer Black’)为试材,利用半定量RT-PCR技术研究不同拉枝处理对‘夏黑’葡萄长、中、短枝上的冬芽成花过程中Vitis vinifera FLOWERING LOCUS T(VvFT)、Vitis vinifera SUPPRESSOR OF OVER EXPRESSION OF CO 1(VvSOC1)、Vitis vinifera LEAFY(VvLFY)、Vitis vinifera APETALA2(Vv AP2)和Viti...

【目的】分离和克隆葡萄品种‘香悦’Vitis vinifera AGAMOUS(VvAG)、Vitis vinifera APETALA 3(VvAP3)、Vitis vinifera FLOWERING LOCUS C(VvFLC)、Vitis vinifera FRUITFUL(VvFUL)、Vitis vinifera FLOWERING LOCUS T(VvFT)、Vitis vinifera APETALA2(VvAP2)和Vitis vinifera SUPPRESSOR OF OVER EXPRESSION OF CO 1(VvSOC1)7个重要花发育相关基因的ORF序列,并对其...

【目的】通过对‘藤稔’葡萄花发育相关基因及物候期的研究,揭示葡萄枝蔓上不同节位芽发育早晚与快慢的机理。【方法】以8年生‘藤稔’葡萄(Fujiminori)为试材,选取生长势基本均匀、粗度基本一致(枝条粗度约为1.15cm),节数约为35节的一年生枝条,采用实时荧光定量PCR技术对8个花发育相关基因(Vv FT、Vv SOC1、Vv AP1、Vv AP2、Vv AP3、Vv FUL、Vv AG和Vv FLC)在不同节位芽中的时空表达特性进行研究。并对其花芽分化的物候期进行观察统计。【结果】‘藤稔’葡萄花芽超节位分化的特点明显。高节位上的花芽分化由底部向上部逐渐进行,上部花芽分化的时间明显短于底部...

为分析‘香妃’葡萄花发育中VvFT和VvTFL1A基因的功能,利用RT-PCR、原位杂交以及酵母双杂等方法研究其在葡萄不同器官、花发育中的功能和基因间的互作方式。结果显示:VvFT与VvTFL1A基因在不同器官中的表达不同,VvFT基因不但可以在花序中生成,而且参与了花发育的整个过程;VvTFL1A基因对花器官的发育影响不大。表明这2个基因在花发育中的作用可能相反。同时酵母双杂的试验表明VvFT和VvTFL1A蛋白都与VvFD蛋白产生互作,并且VvFT与VvFD蛋白之间的互作要强于VvTFL1A与VvFD蛋白,说明VvFT与VvTFL1A基因所起的功能可能都与VvFD有关。

为了解β-葡萄糖苷酶基因是否与葡萄果实成熟有关,从基因库中分离出了3个β-葡萄糖苷酶基因,分别命名为VvBG1,VvBG2和VvBG3,并对其表达进行了分析。结果显示:所获得的3个基因在葡萄浆果成熟过程中均有表达。果皮中,随着果实的成熟,VvBG1变化较平稳;VvBG2在转色期时略有降低,之后不断升高,在完熟期时达到最大值;VvBG3在成熟过程中先升高后降低,在转色期时达到高峰。果肉中,VvBG1和VvBG2分别与果皮VvBG2和VvBG3变化趋势相似;VvBG3在转色前期和成熟期时表达较低,在完熟期达到最大值。种子中,VvBG1在转色前期出现最大值,之后迅速降低;随着果实的成熟,VvBG2不...

利用半定量RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术检测‘藤稔’葡萄microRNA156b(Vv-miR156b)和microRNA172c(Vv-miR172c)及其靶基因(Vv-SPL9和Vv-AP2)在摘心处理(5月14日、5月20日、5月28日)后不同发育时期冬芽中的表达情况,并利用RLM-5'-RACE验证了miRNAs作用其靶基因的方式。结果表明:仅5月28日摘心处理的冬芽能够进行花芽分化并形成花序,而其他处理及对照未能花芽分化。2种RT-PCR检测结果基本一致,5月28日摘心处理的2条miRNAs表达水平明显下降,且花序中有最低表达。相应的靶基因在冬芽二次成花...

为探索ＳＷＥＥＴ基因家族在葡萄果实发育中的表达与功能，以本实验室完成的酿酒葡萄品种赤霞珠Ⅰ期和Ⅲ期果实的转录组数据为基础，筛选出在Ⅰ期和Ⅲ期表达量存在显著差异的９个ＳＷＥＥＴ基因家族成员，利用生物信息学工具，对这９个基因的基因结构、蛋白的基本理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守基序和序列同源性等进行预测分析，并利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）技术对分析结果进行验证。基因组定位结果发现这９个ＳＷＥＥＴ基因分布在７条染色体上，蛋白序列可分成４个亚族。不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异；二级结构预测结果显示，这９个ＳＷＥＥＴ基因的氨基酸序列以α－螺旋和无规则卷曲为主要组成部分．．．

采用RT-PCR法从黄鳝(Monopterus albus)性腺mRNA中克隆获得了WT1基因,根据其氨基酸序列有无KTS区将黄鳝WT1基因分为2种类型:WT1(-KTS)为1 236bp,WT1(+KTS)为1 245bp。与NCBI/GenBank上其他物种进行氨基酸序列比对,发现它们与斜带石斑鱼的WT1a相似性最高,分别为93.2%和93.0%,并且它们均在羧基端具有相似性很高的锌指结构区域。系统进化树分析发现,黄鳝WT1基因与斜带石斑鱼WT1a聚类为一支。WT1基因在黄鳝性腺、肾、肠、脾和心脏组织中都有表达,且该基因在黄鳝雌性、间性和雄性性腺中的表达量在各时期都有先升高后降低的表达趋势...

[目的]本文旨在研究VvAGL11和VvAGL15在应答赤霉素(GA3)信号诱导葡萄无核果实发育过程中的作用。[方法]以‘巨峰’葡萄为试材,鉴定了VvAGL11和VvAGL15的c DNA全长序列,并通过分析基因的启动子顺式作用元件预测其潜在功能,同时运用RT-qPCR方法检测对照和GA3处理组葡萄VvAGL11和VvAGL15的时空表达水平。[结果]GA3处理能够诱导葡萄果实无核化,使葡萄果粒和果穗显著伸长,穗轴增粗。同时,鉴定到VvAGL11(MG581423)和VvAGL15(MG581424)的c DNA全长序列。VvAGL11和VvAGL15蛋白序列与可可和棉花的亲缘关系较近;二者均含有MADS-MEF2-like和K-box家族保守结构域,属于MADS-box转录因子家族;其主要二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,且主要定位于细胞核中,蛋白结构具有保守性。启动子顺式作用元件分析显示:二者均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的motifs。RT-qPCR分析显示,在果实硬核期和转色期的种子中,VvAGL11和VvAGL15的表达量较高,而GA3处理能够显著抑制其在种子中的表达。[结论]鉴定到MADS-box基因家族中的2个成员,分别为VvAGL11和VvAGL15。GA3处理可抑制VvAGL11和VvAGL15在种子区的表达,影响种胚的正常发育,从而形成无核果实。

为了解蜕皮激素受体(EcR)在脊尾白虾卵巢和胚胎发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾EcR基因全长c DNA序列(Gen Bank登录号:KC506600),用实时荧光定量PCR方法分析了EcR基因在雌虾不同组织、卵巢以及胚胎发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾EcR基因全长2 638 bp,开放阅读框1 713 bp,编码570个氨基酸,脊尾白虾EcR在系统进化上与行抱卵繁殖的真虾类和蟹类亲缘关系较近,而与对虾类较远。脊尾白虾EcR基因在各组织中均有表达,但主要在肝胰腺内表达。在脊尾白虾繁殖期内,肝胰腺内EcR的表达量始终高于卵巢,表达量峰值出现在卵巢成熟时期,而卵...

为了解卵黄蛋白原受体（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｖｇ ｒ）在脊尾白虾卵巢发育中的作用，采用同源克隆和ｒＡｃｅ技术，克隆了脊尾白虾ｖｇ ｒ基因全长ｃ ＤｎＡ序列，用实时荧光定量ｐｃｒ方法分析了ｖｇ ｒ基因在雌虾不同组织、卵巢发育不同时期的表达特征。结果显示，脊尾白虾ｖｇ ｒ基因全长５８９２ ｂｐ，开放阅读框５６６１ ｂｐ，编码１８８６个氨基酸。脊尾白虾ｖｇ ｒ具有低密度脂蛋白受体（ｌＤｌｒ）家族典型结构特征，属于ｌＤｌｒ家族，进化上与日本沼虾等甲壳动物ｖｇ ｒ亲缘关系最近，然后与昆虫ｖｇ ｒ分支聚为一支，而与ｌＤｌｒ家族中其他成员亲缘关系较远。脊尾白虾ｖｇ ｒ在各组织中均有表达．．．

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不...

【目的】克隆葡萄风信子MYB转录因子基因(MaMYB1),并对其进行生物信息学和表达模式的分析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种"亚美尼亚"为材料,利用RACE技术得到其MaMYB1基因cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性,并用实时定量PCR方法分析该基因在根、茎、叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过RACE-PCR,克隆得到953bp的MaMYB1基因,其开放阅读框长750bp,编码249个氨基酸,推测的蛋白分子质量约为27.7ku,理论等电点为9.3。MaMYB1基因编码的蛋白序列中具有2个典型的MYB结构域R2和R3,且在R3结构域下游含有...