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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李国强 朱丽萍 朱丽臻 陈蕾蕾 颜世敢
[目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC) CFT073株的双组分信号系统Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032—c5037基因同源臂的氯霉素抗性基因取代c5032—c5037基因,在温度敏感型质粒p CP20作用下消除氯霉素抗性基因,构建基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,用PCR和基因测序验证基因敲除是否成功,测定有氧和厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养不同时间的菌液D600值。[结果]构建了CFT073Δc5032—c5037,PCR验证及基因测序结果均表明已成功敲除c5032—c5037基因;厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中生长比野生型菌株CFT073缓慢,且差异极显著(P
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
程钢 喻子牛
应用多种生物信息学方法,如序列比对、多序列比对、系统进化树分析、二级结构预测等,对阿维链霉菌中双组分信号系统蛋白进行鉴定分析。结果表明:阿维链霉菌中存在61个组氨酸蛋白激酶,其中30个组氨酸蛋白激酶包含了全部的保守传递器结构域。阿维链霉菌中也存在69个应答调控蛋白,主要分布在3种主要的应答调控蛋白家族中。与天蓝色链霉菌和其他微生物中双组分信号系统进行比较和对功能结构域进行分析,表明:在这些蛋白所组成48个双组分信号系统中,多个双信号调控系统与阿维链霉菌中环境刺激反应和调控相关。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
师红亚 董浚键 张德锋 孙成飞 田园园 曾庆凯 卢迈新 叶星
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵良友 高雪丽 刘超男 申海龙 姜南 万伟泉 吕晓萍 郑世民
为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
陈晓萌 王悦辰 柴栩婴 李爱宁 王永林
【目的】欧美杨细菌性溃疡病是革兰氏阴性细菌Lonsdalea populi引起的杨树枝干病害,其危害严重,已造成欧美杨人工林的重要经济损失。双组分系统是细菌致病过程的关键调控途径之一。目前,欧美杨细菌性溃疡病菌的双组分系统如何调控致病过程仍缺乏系统研究。因此,本研究开展欧美杨细菌性溃疡病菌的双组分编码基因的缺失突变及突变体表型分析,为深入解析其致病机制提供遗传材料。【方法】本研究以欧美杨溃疡病菌菌株N-5-1为研究对象,利用双亲结合方法获得了28个双组分系统基因的缺失突变体,并通过表型测定方法分析了这些基因突变体的致病性、生长、游动性、生物膜形成和抗逆性等表型特征,研究不同双组分系统编码基因对该病菌致病过程的调控。【结果】构建了36个欧美杨溃疡病菌的双组分编码基因的敲除重组载体,获得了28个基因的缺失突变体。致病性测定表明18个双组分基因的敲除降低了病原菌的毒性,其中8个突变体毒性丧失。此外,还获得了调控游动性和生物膜形成能力的突变体以及在逆境胁迫反应(金属离子、盐离子、抗生素等胁迫)有缺陷的突变体。【结论】本研究获得了5个显著影响欧美杨细菌性溃疡病菌毒性及其他生物表型的双组分基因,为后续双组分信号调控致病机制研究提供了遗传材料。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘定远 王春元 于永翔 王印庚 李京泽 张晓松 秦蕾 张正
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae， PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象，初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm，比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products， ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物，通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。毒力基因dly缺失后导致PDD菌株的生长变慢，涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低；野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化；与野生株相比，缺失株的生物被膜形成能力有显著性差异(P<0.05)；人工感染实验表明，缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性，并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。
[期刊] 林业科学
[作者]
魏强 李爱宁 贺伟
【目的】明确欧美杨细菌性溃疡病病原菌中双组分信号转导系统LqHK1基因的生物学功能,以阐明该病原菌的致病机制。【方法】采用生物信息学方法鉴定双组分系统LqHK1,利用同源重组方法获得该基因缺失突变体菌株△LqHK1,分析突变体及其互补菌株的生长速率、游动性、生物膜形成、致病性等生物学特性。同时,采用qRT-PCR检测与病原菌游动性相关的基因flgB、flgC、flgE的表达水平,并定量分析接种病原菌后在接种点部位杨树组织内病原菌的DNA含量。【结果】鉴定出病原细菌的双组分系统基因LqHK1,通过同源重组获
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李林俐 朱来旭 张雪 费荣梅
[目的]为研究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌生物学特性的影响。[方法]在野生株XX2的基础上利用Red重组系统构建FliL基因缺失株和互补株。通过对野生株、FliL基因缺失株和互补株的生长曲线分析，探究FliL基因缺失对扬子鳄源普通变形杆菌生物学特性的相关影响；利用细菌具有周期性群集运动特性，通过分析FliL基因缺失株与野生株在固体LB培养基和Mot半固体培养基上的迁移运动，探究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌运动的影响；通过小鼠致病性实验，探究FliL基因对细菌毒力的影响。[结果]生长曲线显示，细菌接种后5 h内FliL基因缺失株与野生株生长速度基本无差别，5 h后其生长速度慢于野生株；细菌群集运动和细菌动力实验显示，FliL基因缺失株群集运动明显减弱，但仍可在Mot半固体琼脂培养基上正常进行迁移运动；小鼠致病性实验显示，野生株XX2的LD_(50)为2.3×10~(6) CFU·mL~(-1)，FliL基因缺失株XX2ΔFliL的LD_(50)为4.9×10~(8) CFU·mL~(-1)，FliL基因缺失株LD_(50)升高了约100倍。[结论]FliL基因缺失可显著降低扬子鳄源普通变形杆菌的群集运动和细菌毒力，将为进一步研究扬子鳄源普通变形杆菌介导的扬子鳄痛风等疾病奠定基础。
关键词：
扬子鳄:普通变形杆菌 FliL基因 毒力
[期刊] 水产学报
[作者]
张燕飞 庞欢瑛 简纪常 鲁义善 汤菊芬 吴灶和
为了研究溶藻弧菌双组分调控系统ＫｄｐｄＥ减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用，本研究采用ＯｖＥｒｌａｐｐＣｒ和同源重组技术，构建了Ｋｄｐｄ／ＫｄｐＥ（ＫｄｐｄＥ）基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究，发现ＫｄｐｄＥ的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显，但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示，突变株毒力下降７８．５倍，表明减毒株构建成功，可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示，注射免疫７ｄ后，鱼体内未检测到该菌。以突变株ΔＫｄｐｄＥ为抗原，分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼，．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
张燕飞 庞欢瑛 简纪常 鲁义善 汤菊芬 吴灶和
为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用OverlapPCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE(kdpDE)基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株毒力下降78.5倍,表明减毒株构建成功,可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示,注射免疫7d后,鱼体内未检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张晶晶 孙慧敏 宋家升 鲍恩东
[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒I型（FHV-1）弱毒疫苗，本研究利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白RFP。[方法]试验构建了针对gIgE基因的3 条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒，将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞（F81），通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化，以重组毒感染F81细胞连续10 代验证其遗传稳定性，通过测定重组毒以及亲本毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]试验结果显示，FHV-1 gIgE基因缺失毒株得到成功构建并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP；提取重组毒DNA通过PCR验证gIgE基因无目的条带，表明重组毒纯化成功，再通过PCR验证RFP基因有目的条带，表明重组毒成功插入外源基因；病毒滴度测定结果显示，与亲本毒相比重组毒的病毒滴度下降了10倍；在F1～F10连续传代过程中可观察到RFP荧光表达且无减弱现象，表明重组毒可稳定表达外源基因；测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线，重组毒的生长趋势与亲本毒大致相同，表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性；噬斑观察及染色结果显示，无论是在病毒感染细胞前期还是后期，重组毒的噬斑都要小于亲本毒，表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]上述结果说明，本研究成功构建并筛选出了FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株，为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了坚实平台与基础。
关键词：
FHV-1 致弱毒株 重组病毒 病毒筛选
[期刊] 水产学报
[作者]
闵洁 汪开毓 刘韬 贺扬 胡伟 罗梦笛
鲁氏耶尔森菌是一种具有广泛致病性的条件致病肠杆菌。三型分泌系统(T3SS)是该菌的重要毒力系统,其中invF基因是T3SS功能表达的重要调控因子。为探讨invF和T3SS对Y.ruckeri致病作用的影响,本研究构建了Y.ruckeri SC09株invF基因的无痕缺失株,并对其生物学特性进行研究。通过融合PCR方法,将invF基因的上、下游片段A、C融合,构建同源臂AC;将获得的同源臂AC连接入自杀质粒pLP12,构建pLP12-invF同源重组载体;pLP12-invF电转化进入供体菌株大肠杆菌β21
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭敏 杨红文 陈知龙 彭音 杨在清
通过构建仅含有aveC基因两端交换臂的缺失载体,与阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体中aveC基因发生同源重组,以阻断该基因,从而获得aveC缺失突变株。并经摇瓶发酵和高效液相色谱检测不同阿维菌素组分产量。结果显示,aveC缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量差异不显著;而阿维菌素组分1的产量下降约58%,组分2的产量提高约52%。
关键词：
阿维菌素 aveC 基因缺失 产素
[期刊] 学位与研究生教育
[作者]
陈超
制度缺失是导致研究生教育收费无法尽快实施的重要原因之一,这种制度缺失既指研究生教育收费缺乏制度依据,也指相关的制度供给不足或不健全。如果在制度缺失的状况下贸然实行研究生教育收费,将对我国研究生教育带来诸多冲击和隐患。因此,加快制度设计及增加制度供给,是保证研究生的合法权益、推动研究生教育合理收费的制度保障。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
颜其贵 郭万柱 余光开 王琴 娄高明
用限制性核酸内切酶NcoI消化含有伪狂犬病病毒(PRV) Fa株Bam HI-7片段的质粒PBB7,以低融点琼脂糖回收目的片段, 经连接并转化E.coliDH5a, 获得缺失了gI和部分gp63基因的重组质粒PPB7-1。将PRVFa与PPB7-1DNA共同转染PK15单层细胞,待出现50% 以上细胞病变时收获病毒, 并以蚀斑法得到纯化重组病毒株, 命名为PFDI/D63。小鼠试验证实, 缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。
关键词：
伪狂犬病病毒 基因缺失 重组
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