【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158—162 kb。与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′端连续插入3 513 bp(2 716—6 228位核苷酸)导致UL56基因移框突变。目前关于DEV基因功能、致病机理等报道较少。本研究通过构建了重组病毒,以研究连续3 513 bp插入对DEV生物特性的影响;【方法】以提取的DEV基因组DNA为模板,分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d。将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体,获得重组质粒pT-UL56ud。将重组质粒pT-UL56ud用Mlu I酶切,电泳回收去磷酸化后,将红色荧光蛋白(RFP)表达盒插入到pT-UL56ud中,获得重组质粒pT-UL56-RFP。DEV接种鸭胚成纤维细胞(DEF)(MOI=0.1),吸附1—2 h后,按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP,通过同源重组的方法,以红色荧光蛋白(RFP)基因为报告基因,构建了缺失DEV UL56下游3 513bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。将重组病毒及其亲本病毒分别接种25 cm2的细胞瓶中(MOI=0.01),测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释,接种已长成单层DEF,加入M199营养琼脂糖覆盖,培养5—7 d,随机选取20个蚀斑,测量蚀斑面积;将重组病毒、回复株及其亲本病毒分别以105.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行致病性试验,观察10 d,每天记录发病死亡情况。试验结束后剖检所有存活鸭。对全部动物取肝脏组织,固定于4%多聚甲醛溶液,按常规程序制备病理切片并进行H.E染色;将重组病毒及鸭瘟商品化活疫苗株(CVCC AV1222)分别以103.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行免疫原性试验,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),每只103.0MLD。观察10 d,每天记录发病死亡情况。【结果】通过同源重组的方法,获得携带RFP的重组病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3 513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种DEF后72 h,病毒含量达到峰值(106.2-6.5TCID50/0.1 mL),病毒含量无明显差异;均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑,大小无明显差异;DEVΔ3513对6周龄易感麻鸭毒力明显减弱,未出现任何临床症状和死亡;DEVΔ3513以103.0TCID50/只免疫麻鸭,能抵抗DEV强毒株的攻击;【结论】成功构建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重组病毒,首次证实UL56基因下游3 513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的;缺失UL56基因下游3 513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3 513 bp是DEV的一个毒力决定因子。

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Westernblot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStarProtean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20—Leu25、Ser40—Met47、Leu6...

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10~3-10~6TCID_(50))rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以10~8EID_(50)的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10~3TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10~4-10~6TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价在1:2~(2.4)-1:2~3。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10~3、10~4、10~6TCID_(50)免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10~5TCID_(50)免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

【目的】鸭肠炎病毒（ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ｄｅｖ）不同毒株间存在明显差异，ｄｅｖ疫苗株的ｕＬ２基因在１９５ｂｐ后连续缺失５２８ｂｐ，导致第６５位氨基酸后连续缺失１７６ａａ～（［１］）。将绿色荧光蛋白（ＧＦｐ）基因插入ｄｅｖ ｕＬ２基因中，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒，以研究ｕＬ２基因对ｄｅｖ生物特性的影响和探讨ｄｅｖ作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的ｄｅｖ细胞适应株ｄｎａ为模板，利用ｐｃｒ技术扩增出病毒ｕＬ２基因上下游序列并克隆入ｐＭｄ－１８ｔ载体；以ｕＬ２基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂，将ｃＭｖ启动子控制的含有ＧＦｐ－Ｇｐｔ基因表达盒克隆入ｄｅｖ．．．

【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌...

【目的】探讨壳聚糖对鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)gC基因疫苗免疫反应的影响。【方法】应用壳聚糖作为DEV gC基因疫苗(pcDNA-DEV-gC)递送载体,采用肌肉注射和口服单次免疫Balb/c小鼠50μg剂量基因疫苗,并以肌注不同剂量裸质粒组、弱毒组和生理盐水组作为对照,分别检测不同疫苗免疫后的细胞、体液和黏膜免疫水平。【结果】肌注壳聚糖疫苗组诱导小鼠产生较肌注裸质粒50μg组和口服壳聚糖疫苗组高的细胞和体液免疫反应,且产生与弱毒疫苗相似的细胞免疫应答,但弱毒疫苗诱导体液免疫的能力更强,仅口服壳聚糖疫苗组产生粘膜免疫。【结论】上述研究结果表明壳聚糖具有一定的...

从六个猪场采集严重发生腹泻的病死仔猪和剖杀的濒死仔猪的肠系膜淋巴结和扁桃体用免疫荧光技术作猪传染性胃肠炎病毒抗原检查。并且用肠系膜淋巴结病料进一步作病毒分离。将处理病料接种到原代猪甲状腺组织培养细胞。盲传九代后出现恒定典型的细胞病变,再适应猪肾传代细胞IBRS—2获得成功。从六份病料中分离出一株具有典型细胞病变的毒株通过电镜形态学观察,理化特性和血清学鉴定为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。

应用ST细胞,从临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠内容物中分离得到一株病毒,并对该病毒进行RTPCR,直接免疫荧光与动物回归等试验,证实该病毒为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为JS2012株。应用PCR方法克隆出其初代(P1TS)与50代(P50TS)的S基因片段,进行序列测定,并将该基因序列与已发表的18个不同来源的TGEV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析。结果表明,各毒株间核苷酸同源性为96.0%～99.9%,氨基酸的同源性为96.5%～99.9%。TGEVJS201PITS株与中国江苏省HN2002株和美国Miller M6亲缘较近,表明不同地区分离毒株的S基因差异不大,而与P1T...

通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体p ET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 k Da。Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和H...

采用RT-PCR和重组PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)TSX毒株纤突蛋白(spike protein,S)基因全长cDNA序列,分离纯化PCR产物,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pGEM-S,并对其进行酶切鉴定和测序,对测序结果及推导氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,S基因全长为4 350 bp(GenBank登录号DQ001167),编码1 449个氨基酸,N端前16个氨基酸为推测的信号肽序列,其后1 433个氨基酸构成成熟蛋白;与GenBank中已发表的9个TGE...

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测的标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增,并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明:该方法检测灵敏度可达30拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有重复性好、特异...

猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染仔猪能够引起仔猪肠道损伤,导致仔猪腹泻脱水甚至死亡,其致病机制主要在于破坏猪小肠黏膜,引起肠道黏膜上皮屏障功能受损,具体主要表现为:TGEV破坏仔猪肠道上皮机械屏障完整和电解质平衡,扰乱生物菌群结构,降低局部免疫功能。TGEV诱导炎症及先天免疫反应的作用机制主要通过激活维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RLR)和Toll样受体(TLR),使核转录因子(NF-κB)活化,进一步诱导细胞因子和干扰素表达。通过饲粮中添加氨基酸、维生素和中草药等营养调控措施可以达到缓解TGEV损伤肠道屏障功能的目的,为预防及治疗TGEV感染对仔猪肠道屏障功能的影响提供参考。

【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的猪肾细胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组,在测定了病毒半数感染细胞量(TCID50),复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后,制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中...

【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体p EGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells,...

旨在探究DEAD-box解旋酶21（DDX21）对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹（Western Blot）分析了TGEV感染对DDX21表达的影响；进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系，运用荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光（IFA）和半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用；构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒，鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示，在TGEV WH-1株感染早期，PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调；RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID₅₀试验显示，超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度，且呈剂量依赖性，其601—784 aa区域是其影响TGEV复制的关键；与阴性对照相比，在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制，而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域，为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。