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[期刊] 华北农学报
[作者]
刘佳 黄丛林 吴忠义 张秀海 王永勤
番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CVB)、菊花褪绿斑驳类病毒(CChMVd)是侵染菊花的3种主要病毒,严重影响菊花品质。利用Blast及分子生物学软件DNAStar对TAV、CVB、CChMVd基因序列同源性进行分析比较,选用TAV的277 bp(1 810～2 086),CVB的281 bp(496～776),CChMVd的217 bp(109～325)的部分基因片段,应用重叠延伸PCR技术将其拼接成融合基因CBT,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有"正向CBT片段-内含子-反向CBT片段"的RNAi的植物表达载体,为培育抗3种病毒的菊花优异种质资源奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
田莉莉 牛良
为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体p HELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。
[期刊] 华北农学报
[作者]
斯钦巴特尔 莫日根 哈斯阿古拉 张剑峰
以甜菜丛根病根或病叶总RNA为模板,经反转录PCR扩增合成编码BNYVV CP的全长cDNA,将其克隆于pUCm-T载体上,获得了重组质粒pUCm-T/CP。经序列分析,此cDNA为一个567 bp长的开放阅读框架,编码由188个氨基酸组成的病毒外壳蛋白。又将CP基因构建到植物双元载体pROKⅡ中。最后通过三亲融合,得到了融合农杆菌LB4404。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁芳 邓祖丽颖 许申平 张燕 崔波
【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。
[期刊] 华北农学报
[作者]
高乐 翟锐 丁雪妮 李凯 章红运 王涛 智海剑
应用基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理的大豆转基因技术,能够在转录水平沉默同源靶基因,这为转基因抗病毒作物的培育提供了新的策略。通过比对已报道的能与病毒VPg发生互作的10种植物的eIF4E氨基酸序列,确定出大豆eIF4E的保守区间为62~237位氨基酸序列,克隆出406 bp的干扰片段eIF4Ei(含58 bp特异性重组序列attB),进而采用GATEWAY技术构建了干扰表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)-eIF4Ei。之后通过测序证实干扰片段eIF4Ei在载体构建过程中没有发生变异;酶切试验证实终端质粒的2个ccdB位点均被eIF4Ei置换;用启动子和终止子设计...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张进忠 孙嘉曼 李朝生 刘挺燕 范燕萍
【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
任秀艳 乔洁 张江丽
根据拟南芥RS基因的编码序列设计引物,利用PCR技术从pGADT7-RS重组质粒上扩增到RS基因编码区476 bp片段。利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建RS基因沉默表达载体,为进一步研究该基因在植物与蛋白激发子HpaGXoo互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将RS基因片段连接到pUCm-T载体上,用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I分别对pUCm-RS重组载体进行酶切,得到2个RS基因片段;先后将其连接到用相应限制酶酶切的pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-RS-in-RS重组载体,该重组载体中的2个RS片段大小一致,反向重复;最后用Sac I/Kpn I酶切pB...
关键词：
RS基因 基因沉默 载体构建
[期刊] 水产学报
[作者]
黄桂菊 陈健光 喻达辉 曾令兵 龙华
利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
徐玲娜 汪阳东 陈益存 张姗姗
油桐(Vernicia fordii(Hemsl.)Airy-Shaw)隶属大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia Lour.),是我国重要的工业油料树种,利用油桐籽榨取的桐油是一种优质干性油,在涂料、油墨、合成树脂、药品等领域有着广泛的应用[1]。桐油中80%以上是桐酸,涂料生产要求桐油中桐酸含量高,而制造优质生物柴油则要求单不饱和脂肪酸含量尽量高,因此,根据
关键词：
油桐 DGAT2 RNAi 双向启动子
[期刊] 华北农学报
[作者]
张森燕 吴忠义 张秀海 刘占磊 王永勤 黄丛林
构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178。收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株。并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
关晓溪 许涛 梅伟利 李天来
作为一种重要的植物激素,生长素在植物体内的作用与其生物合成密切相关,并受其信号转导中的转录因子调控。ARF是一类关键的生长素响应因子,近年来其分子机理的研究逐渐成为热点,其在植物各组织器官和多种生理活动中的功能探究取得了很大进展。利用Gateway克隆技术构建了ARF14的RNAi载体,并通过测序和酶切方法均验证了其正确性。在已建立的中蔬6号番茄高效再生体系的基础上,根据实际情况稍加改进,利用农杆菌介导的遗传转化法将目的载体导入植株,获得了一部分阳性转化植株,转化率均高于30%。组织特异性表达分析结果表明:Sl ARF14基因在大部分组织器官中均有表达,尤其是雌蕊、花蕾、叶片以及膨大期的果实。...
[期刊] 草业科学
[作者]
张亚楠 蔺银鼎 孟林 毛培春 田小霞 郭强
重金属ATP酶基因HMA2介导的Cd长距离运输对植物体内Cd的分配及解毒起重要作用。然而,有关马蔺(Iris lactea)体内Cd长距离运输的分子机制仍不清楚。本研究以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有IlHMA2基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARTG1G2,用冻融法将此重组质粒导入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了Il
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王彩平 龚晓明 杜念兴
以促黄体素释放激素(LHRH)基因克隆质粒(pBS-LHRH)为乙肝表面抗原(HBsAg)基因的插入受体,使LHRH基因融合到HBsAg基因的3'末端(224位氨基酸处),实现HBsAg基因3'末端的Bgl Ⅱ与LHRH 基因5'末端BamH 切口按连续框架的融合。酶切分析得到大约740 bp的LHRH::HBsAg融合基因。序列分析表明融合基因阅读框架正确。将此融合基因经酶切位点改造,插入到家蚕核多角体病毒转移载体pBE 284的多克隆位点中。经酶切分析和southern blot鉴定,证实重组转移载体构建成功。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李根英 夏兰芹 夏先春 何中虎
【目的】构建Pina、Pinb融合基因表达载体,验证Pina和Pinb基因的功能,为利用转基因技术改良小麦籽粒质地提供理论依据和基础材料。【方法】以软质小麦京411作为Pina和Pinb基因的供体,将Pina、Pinb基因融合后,与基础质粒pG4AB上的Ω和poly(A)等增强基因表达的调控序列及pAHC25上的Ubiqutin启动子和bar基因表达盒相连接,构建Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体。利用基因枪转化硬粒小麦幼胚,并对硬粒小麦幼胚再生体系进行探索。【结果】在构建完成Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体pFUBPaPb的基础上,转化硬粒小麦幼胚16000多枚,经biol...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张立 王建锋 王晓杰 康振生 韩德俊
以小麦品种西农1376为受体,利用Overlapping PCR的方式构建了防御素基因alfAFP和抗菌肽基因spCEMA融合基因的表达载体,与pAHC20共转化幼胚愈伤组织,获得转基因再生T0代植株269株,春化后移栽成活188株。对叶片基因组DNA进行目的基因和bar基因PCR扩增表明其中7株是共整合植株,共整合频率为0.1%,初步证明融合基因已成功通过共转化方式导入受体小麦品种中。影响共整合率的因素分析表明,在使用除草剂PPT对bar基因进行筛选的过程中,筛选时间的缩短并不会明显降低筛选的效率。
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小麦 转基因 融合基因 共转化
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