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[期刊] 林业科学
[作者]
程晓甜 阿地力·沙塔尔 张伟 李新泉 玛依拉
应用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇的方法。利用枣实蝇(mtDNA)中COⅠ基因序列,设计筛选出1对种的特异引物CarF/CarR。引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇5种实蝇来验证。SYBR Green PCR实时荧光反应的灵敏度用40,20,10,1,0.1,0.01,0.001 ng·μL-17个浓度枣实蝇DNA模板来检测。结果表明:SYBR Green PCR的检测限度达0.01 ng·μL-1以下,最适模板DNA浓度为1~20 ng·μL-1。SYBR Green实时荧光PCR的可靠性可用枣实蝇...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
邱驰 董薇 曹际娟 段玉玺
根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘建越 邓欣 康林 余道坚 高必达 陈冬美
分别以RBCL基因和PRSV-CP基因、PRSV-RP基因为内源基因和目标基因,设计了3对特异性引物,对转基因番木瓜进行了SYBRGreen实时荧光PCR检测.结果表明,RBCL基因引物对所有供试样品成功扩增,Ct值为15～16,PRSV-CP引物对转PRSV-CP基因番木瓜样品成功扩增,Ct值为20～25,PRSV-RP引物对转PRSV-RP基因番木瓜样品成功扩增,Ct值为21～22.运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丽 赵绪永 陈红英 崔保安
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
修金生 吴顺意 曾新斌 陈小权
参考GenBank上的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,根据其开放阅读框ORF1保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法来检测PCV2.所建立的荧光定量PCR方法最低检测限为82.2拷贝.反应-1,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍.扩增产物的融解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(85.98±0.13)℃,对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒无扩增,可重复性好,组内变异系数为0.29%-1.35%,组间变异系数为0.96%-2.42%,检测速度快,从样本处理到报告结果得出仅需3 h....
[期刊] 水产学报
[作者]
曹泽艺 周庆杰 陈凯 习丙文 谢骏 潘良坤 毛颖
为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。
[期刊] 华北农学报
[作者]
马鹏 李林杰 常秋燕 王悦萦 郭富城 刘萍 马晓霞 马忠仁
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片
[期刊] 水产学报
[作者]
荣小军 廖梅杰 张正 王印庚 刘智超 李彬 王岚 陈贵平
根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在T m为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x+39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,3个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。研究表明,所建立的实...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙炳剑 陈清清 袁虹霞 施艳 李洪连
【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeum...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙炳剑 陈清清 袁虹霞 施艳 李洪连
【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一，早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂，而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测，研究旨在建立小麦纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅＲｅａｌｉｓ）的ｓＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ实时荧光定量ＰｃＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β－ｔｕＢｉｌｉｎ序列，设计１对特异性引物，建立并优化ｓＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ反应体系，利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（Ｒ．ｓｏｌａｎｉ）、双核丝核菌ａＧ－ａ和ａＧ－Ｆ菌株、小麦全蚀病菌（Ｇａｅｕｍ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾艳艳 李明凤 王东方 崔保安 陈红英 魏战勇 吕晓丽 郭显坡
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张晓君 姚东瑞 阎斌伦 秦蕾 毕可然 梁利国
基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
于永翔 王印庚 刘智超 廖梅杰 张正 荣小军 李彬 战文斌
灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋月 程琨 梁秀丽 王亚宾 付彤 韩立强 魏战勇
为了建立绿脓杆菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法,以便更加快捷、方便的检测绿脓杆菌,根据16S rDNA高度保守的特性,在绿脓杆菌16S rDNA保守区设计1对引物,利用普通PCR技术扩增出绿脓杆菌16S rDNA保守区277 bp的片段,并克隆到pMD-18 T载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了绿脓杆菌的荧光定量PCR检测方法。并对方法的灵敏性、特异性、重复性进行评价,又进一步在临床实践中进行检验。结果显示,所建立的方法对标准样品的最小检出浓度为28拷贝/μL。并且特异性检验结果显示与常见的菌群没有交叉反应,重复性良好...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭慧娟 李秀丽 张国伟 鄢明华 王利丽 张莉 孙英峰
通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种检测PCV2的SYBR Green荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪1型圆环病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等均无交叉反应。该方法最低可检测到10拷贝/μL的DNA,比PCR检测方法敏感性高1 000倍;其标准曲线线性范围是6.84×102~6.84×107拷贝,且具有良好的重复性。
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