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[期刊] 西南农业学报
[作者]
唐喆 王光辉
【目的】为克服传统抗病水稻材料抗病性易于丧失的缺点。【方法】利用寄主诱导基因沉默(HIGS)技术创制水稻抗稻瘟菌的新材料。【结果】首先,选取稻瘟菌信号肽复合物中的关键亚基SEC11为靶基因,利用Gateway基因重组技术将稻瘟菌SEC11基因的干扰片段构建到pBDL03载体上获得HIGS表达载体。通过农杆菌介导的转化法,成功将SEC11基因的HIGS载体导入水稻品种日本晴中获得阳性转基因水稻植株。最后,通过水稻叶片喷雾接种试验,证明以稻瘟菌SEC11基因为靶标的HIGS转基因水稻对稻瘟菌具有显著的抗病性。【结论】本研究创制了新的抗稻瘟病水稻材料,将HIGS技术应用于抗稻瘟病分子育种提供了科学依据。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
唐喆 张强 项萍
【目的】使用Gateway技术构建稻瘟菌RHO1基因寄主诱导的基因沉默（HIGS）表达载体，将其转化入水稻后，观察稻瘟菌对转基因水稻的致病力。【方法】利用PCR技术从稻瘟菌cDNA扩增RHO1基因，通过Gateway技术构建pBDL03-RHO1载体，电转化进入农杆菌AGL1；以水稻日本晴为材料，通过农杆菌介导的转化方法获得转基因水稻植株，并对其接种稻瘟菌，分析转基因水稻对稻瘟菌抗性。【结果】通过 PCR 扩增获得了RHO1基因片段，利用BP反应构建了入门载体 pDONR 221-RHO1，采用LR反应构
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
常欣 庞磊 李叶云 魏艳丽 江昌俊
【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0℃下处理48h后,检测其膜质通透性、丙二醛(MDA)含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0℃处理3d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】成功构建表达载体pBI121-C...
关键词：
茶树 烟草 CsCBF1基因 抗寒性
[期刊] 林业科学
[作者]
陈英 戴咏梅 黄敏仁 诸葛强 王明庥
多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王海光 张洪亮 段俊枝 李自超
为研究水稻肌醇加氧酶基因在植物水分胁迫分子应答中的作用,采用RT-PCR技术克隆了水稻肌醇加氧酶基因的cDNA编码区,命名为OsMIOX。该基因由927个碱基组成,编码308个氨基酸,与拟南芥肌醇加氧酶的氨基酸序列相比,同源性为78%。将克隆的OsMIOX基因连接pCAMBIA-1301载体,成功构建了35 s启动子驱动的植物超表达载体。实时定量PCR分析结果表明,水分胁迫下OsMIOX基因在旱稻IRAT109中上调表达,在旱稻(IRAT109和毫格劳)中的表达量显著高于水稻(越富和日本晴)。这说明水稻和旱稻的水分胁迫分子反应机制的确存在差异,而这种差异很可能就是水、旱稻抗旱性不同的原因之一。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张红心 王桂兰 陈超 赵璞 马春红
为研究细胞分裂素在水稻籽粒发育中的作用,构建了p1300-p PG-5α-IPT-Nos植物表达载体,并对水稻进行遗传转化。以水稻品种9311为材料,采用PCR法获得种子中特异表达的PG-5α基因启动子,并将此启动子与p1300相连接,构建p1300-p PG-5α载体,用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切p SG516,获得IPT-Nos核酸片段,然后将此核酸片段插入到p1300-p PG-5α中,构建p1300-p PG-5α-IPT-Nos植物表达载体。以水稻品种日本晴愈伤组织为材料,采用农杆菌介导的方法进行遗传转化。成功构建了植物表达载体p1300-p PG-5α-IPT-Nos,获得了阳性率为...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孟凡宏 宋从凤 纪兆林 王金生
将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105。采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株。通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析。结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达。用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王青云 王润青 方聪燕 侯佩 苏亮 李建平 宋梅芳 杨建平 李雪梅 吴大付
为克隆水稻蛋白磷酸酶6(PP6)催化亚基基因OsPP6C,并构建该基因的过表达载体以及进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术从水稻中花11叶片cDNA中扩增OsPP6C基因全长,并构建与GUS融合的pBI121-OsPP6CGUS表达载体。通过生物信息学方法分析了OsPP6C蛋白的理化性质、与拟南芥AtPP6C(即AtFyPP)之间的同源性以及不同物种间的系统发育关系,此外,对OsPP6C基因的启动子进行了顺式作用元件分析。结果表明,该基因转录序列包含一个912 bp的开放阅读框,编码303个氨基酸残基,蛋白的分子量约为3.47 kDa,等电点为5.13;具有疏水性,但不存在信号肽,属于非分...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王晓静 孙林静 孙玥 张融雪 李军玲 闫双勇 苏京平
为研究水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因在非生物胁迫中的生物学功能,根据OsPIP2;7基因序列设计特异性引物,以水稻品种中花11的三叶龄叶片RNA反转录的cDNA第一链为模板,克隆OsPIP2;7。采用嵌套PCR的方法,将3×HA标签的碱基序列连接在去除终止子OsPIP2;7基因序列的3′端,然后将此核酸片段插入到植物双元表达载体pHB中,构建pHB-OsPIP2;7-3×HA载体。以中花11成熟胚愈伤组织为材料,采用农杆菌介导的方法进行遗传转化,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得阳性转化子。提取转基因植株的DNA,进行潮霉素阳性植株的筛选。将阳性植株进行RNA表达检测,获得OsPIP2;7基因表达量上升的转基因阳性植株。为了检测转基因植株中OsPIP2;7蛋白的表达情况,提取OsPIP2;7基因表达上升的转基因植株膜蛋白后,用HA抗体进行杂交的Western-blot检测结果显示,OsPIP2;7-HA蛋白在转基因阳性植株体内过量表达。获得的过表达OsPIP2;7转基因新材料,将为研究OsPIP2;7基因的生物学新功能提供试验基础。
关键词：
水稻 水孔蛋白 HA标签 蛋白表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
程妍 曲玮茵 郑文博 杨媚 廖美德 周而勋 舒灿伟
克里本类芽孢杆菌PS04是一个水稻纹枯病的高效生防菌,为研究该菌诱导水稻抗性相关基因的表达谱,用PS04菌株发酵液处理水稻24 h后于3,6,9,12,24 h取样,利用荧光定量PCR检测样品中抗性相关基因的相对表达量。结果如下:PS04菌株发酵液能够诱导8个防卫反应基因(OsPR1、OsPR2、OsPR3、OsPR4、OsPR5、OsPR10、OsPR16和NPR1)、2个水杨酸途径基因(PAL和OsNAC4)和3个茉莉酸/乙烯途径基因(AOS2、LOX和EIN2)的表达。其中NPR1和LOX基因在第3小时表达量达最高随后下降;OsPR3、OsPR4、OsPR5、OsPR16和PAL基因在第6小时表达量达最高随后下降;OsPR1和OsNAC4基因在第9小时表达量达最高随后下降;OsPR10基因在第12小时表达量达最高随后下降;OsPR2和EIN2基因在第24小时表达量达到最大值;AOS2基因的表达受抑制,在第6小时表达量达最高随后下降。结果表明,PS04菌株可以同时诱导水稻系统性获得抗性和诱导性系统抗性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
蔡曼 李卫华 柳延涛 余渝 孔宪辉 王娟 王旭文 刘丽
为研究Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因的功能及其与植物抗寒性的相关性,以陆地棉GhSAD2基因(KX197920)为目的基因,构建植物表达载体pBI121-GhSAD2,将该表达载体通过电击法导入根癌农杆菌GV3101中,采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草。通过PCR和GUS活性染色鉴定外源GhSAD2基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。将转pBI121-GhSAD2型和野生型烟草置于4℃下处理48 h后,检测其电解质渗漏率并观察其表型。研究结果证明目的基因GhSAD2已整合到烟草及棉花的基因组中,共
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙琦 刘香玲 张宁 余柏胜
水稻苗期冷害是导致水稻减产的重要因素之一。为了发掘新的耐冷基因、诠释其耐冷分子机制并应用分子育种的手段提高水稻苗期耐冷性,前期已通过Northern表达分析,从已构建的水稻苗期低温诱导表达正向抑制差减cDNA文库中,发现了一个受低温诱导上调表达的功能未知的C2H2型锌指结构域蛋白新基因(特命名为OsCOI)。本研究进一步通过RT-PCR的方法从水稻中克隆了该基因,构建了其植物过表达载体,并通过农杆菌介导转入水稻基因组中,获得了其过表达转基因水稻株系,为进一步研究该基因的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘莉 刘鹏 金佳丽 吴海丽 王改改 江晨 采克俊
Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的...
关键词：
草鱼 Mx基因 克隆 序列分析 载体构建
[期刊] 华北农学报
[作者]
田华 徐春霞 段美洋 黎国喜 唐湘如
利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因。DNA序列分析表明,所获得水稻的PROcDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸。该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似。为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定。
关键词：
香稻 脯氨酸氧化酶 基因 克隆 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
王聚财 刘运超 陈玉梅 孟凤丽 王爱萍 张二芹 许倩茹 邓瑞广 张改平
利用水稻胚乳细胞生物反应器,构建含有HPV45-L1和HPV58-L1基因的重组植物表达载体,为HPV-45L1和HPV58-L1蛋白的表达提供一种新的高效、低廉的表达方式。利用PCR技术克隆人乳头瘤病毒HPV45-L1和HPV58-L1蛋白编码基因,将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA-1300中,构建含HPV45-L1和HPV58-L1基因的植物表达载体pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1,随后采用根癌农杆菌侵染水
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