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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
谷文峰 李新华 刘希颖 胡兰
用RT-PCR扩增含有XhoI/EcoRI酶切位点的Sirt1片段,克隆、测序后,构建真核荧光表达载体pEGFP-N1-Sirt1、脂质体介导转染293细胞,最后利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明,经脂质体介导重组体pEGFP-N1-Sirt1可成功转染293细胞;转染48h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达;SDS-PAGE证明表达的融合蛋白相对分子质量约为41kD。该结果为进一步研究Sirt1在哺乳动物细胞中的作用奠定了基础。
关键词：
Sirt1 基因克隆 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 杨志军 王群 渡部终五
【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(N...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
江学斌 马苗鹏 肖淑君 司徒嘉欣 杨军 施巨清 蔡海明 张玲华
根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。
关键词：
猪 SIRT1 PCR 多克隆抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李玲玲 张伟 杜蕊 宋玲珍 柴学军 胡新德 陈树林 赵善廷
【目的】构建能够在神经系统中高效表达的小鼠cofilin-1野生型(Cfl1-wt)、活化型(Cfl1-S3A)、失活型(Cfl1-S3D)3种真核表达载体,并研究其在鸡胚脊髓神经元中的表达情况,为进一步探讨cofilin-1在大脑发育过程中对神经元迁移的影响奠定基础。【方法】从成年小鼠大脑组织中提取RNA,经反转录获得cDNA样本,RT-PCR扩增小鼠cofilin-1基因的CDS区,经引物设计引入点突变,扩增了野生型、活化型及失活型的cofilin-1基因片段,克隆入pCAG-MCS-myc真核表达载体中。经双酶切和测序鉴定后,转染CHO细胞,通过半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测其在细...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杜学海 曹蕊 萧鹏 李伯江 吴望军 刘红林
为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李碧侠 赵芳 付言峰 任守文 王金玉
【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,>1.5~≤3.0mm,>3.0~≤5.0mm,>5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最...
关键词：
SIRT1基因 猪 卵泡发育
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙星虹 孙晓凤 孙雷雷 李兰
为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RTPCR方法,从13.5 dpc雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pc DNA3.1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。
关键词：
Dazl基因 真核表达载体 转染
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
安磊 孙婵 解芸菲 王勇 吕彬 孙超
【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和...
关键词：
细胞凋亡 SOCS3 pEGFP-N1
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李明昭 刘超 孙军伟 朱海鲸 曹晖 吕晓 仇普斌 华进联
【目的】研究雄性奶山羊Prm1基因的表达规律并克隆该基因,为奶山羊精子发生过程的研究提供分子基础。【方法】利用PCR技术从关中奶山羊睾丸组织中扩增出Prm1基因的全CDS序列,对其进行同源性比较和进化比较。同时用PCR、western blotting及免疫组化技术检测Prm1在不同年龄雄性关中奶山羊睾丸中的表达。将克隆出的奶山羊Prm1基因与pIRES-GFP载体连接构建重组真核表达载体,转染GC1细胞和人的脐带基质细胞检测Prm1基因的超表达情况。【结果】Prm1基因在成年奶山羊睾丸组织中的表达量很高,且只定位于精子头部,在其它时期的睾丸组织中基本不表达。同时扩增得到了关中奶山羊Prm1基...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵芳 任守文 赵为民 付言峰 李碧侠
构建猪ＳＩＲＴ１基因全长编码区（ｃｏｄＩｎｇ ＲｅｇＩｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｃｄＳ）的真核表达载体，转染猪原代卵巢颗粒细胞，探讨ＳＩＲＴ１基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中ＡＭＰＫ基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明，猪ＳＩＲＴ１基因的ｃｄＳ区全长大小为２ ２２９ ｂＰ，与ｎｃｂＩ发布的猪ＳＩＲＴ１基因Ｍ ＲｎＡ序列（ｅｕ０３０２８３．２）一致；转染Ｐ ｅｇＦＰ–ｃ１–ＳＩＲＴ１载体的颗粒细胞中ＳＩＲＴ１的Ｍ ＲｎＡ表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组（Ｐ
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李冉 王尧尧 李运生 方富贵 李福宝
【目的】探讨ＮｅｓｆａｔｉＮ－１在大鼠生长轴（下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、肌肉）中的定位及其ｍＲＮａ的表达情况。【方法】对雌性大鼠进行深度麻醉灌注后，采集下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌肌肉组织，放入４％多聚甲醛溶液中固定，采用免疫组化ＰＶ－９０００二步法、ＤａＢ显色技术检测ＮｅｓｆａｔｉＮ－１在生长轴上的分布，另取雌性大鼠断头处死，取相同组织用荧光定量ＰＣＲ方法检测其中ＮｅｓｆａｔｉＮ－１ｍＲＮａ的表达情况。【结果】ＮｅｓｆａｔｉＮ－１主要分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、室周核、外侧区、弓状核、视上核、腺垂体、胰腺的胰岛和腺泡及肝脏与肌肉中。平均光密度分析显示，ＮｅｓｆａｔｉＮ－１在室周核．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李军 吕长荣 窦琳 窦忠英
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于巧平 尹明安 任小林 姜永华
【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以"皇家嘎啦"苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王杰 奥旭东 李文斌 白海栋 岳永莉 于海泉
【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fab...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
董建宝 谢芝勋 孙建华 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。
关键词：
鸡γ-干扰素 绿色荧光 真核表达
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