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[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 周金林  沈杰  
应用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离伊氏锥虫安徽株克隆虫体 ShTatl 的二个抗原变异体ShTatl.3和 ShTatl.5总 RNA,在含有甲醛的琼脂凝胶电泳后,转印到硝酯纤维膜上.根据布氏锥虫 VS-Gm RNA3′端保守序列,设计合成了一个互补于它的含18个碱基的寡恢苷酸5′-GGTGTTAAAATA-TATCAG-3′.经~(32)P 标记、Northern 杂交,首次证明伊氏锥虫含有同样的保守序列.利用合成的18碱基寡核苷酸作为反转录特异引物,成功合成 cDNA 第一链,以 cDNA 第一链作为 PCR 扩增模板,均能特异性的扩增出一条主带为1.5kb 的 DNA,与 VSG 基因大...
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 陈德胜  潘杰彦  贾立群  戴亚斌  蔡宝祥  陈溥言  
以传染性支气管炎病毒 (IBV)标准毒株M41为材料 ,根据Genbank公开序列自行合成一对特异引物 ,用于扩增IBV的完整S1基因。建立了针对IBV基因组RNA特点的RT PCR方法。对反应体系中的重要反应物Mg2 +、dNTP和引物浓度进行优化 ,确定其浓度值分别为 1 5mmol/L ,2 0 0 μmol/L和 40 μmol/L。使用此反应体系对国内IBV地方分离毒株JS/95 / 0 3 ,SD/ 97/ 0 1等 10多个毒株的S1基因进行扩增 ,均扩增出预期 1 7kb的完整S1基因 ,说明此方法对于IBV的S1基因扩增具有一定的通用性
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 谢晋  沈永林  汪志楷  
初步研究了伊氏锥虫(T.b.evansi)对人血清敏感性的变异。以不断递增的人血清处理在免疫抑制鼠体内连续传代的伊氏锥虫,经20代的压力选择,获得了能耐受0.5mL正常人血清的抗性变异克隆。该变异克隆在无人血清压力的正常鼠体内经10次连续传代,又恢复了对人血清的敏感性。结果表明,伊氏锥虫对人血清的敏感性或抗性均不稳定。
[期刊] 西南农业学报  [作者] 陈阳婷  桑有顺  冯焱  陈涛  
为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒...
[期刊] 华北农学报  [作者] 李亚青  葛荣朝  赵保存  沈银柱  
利用RT-PCR法检测在盐、ABA、冷胁迫下TaGSK1基因的表达,结果表明,该基因在这几种胁迫下的表达均有提高,说明TaGSK1基因在对抗盐、ABA和冷逆境胁迫信号通路中具有重要作用。
[期刊] 林业科学  [作者] 薛永常  李金花  卢孟柱  张绮纹  
A fragment of PAL (phenylalanine ammonia_lyase) gene was amplified by RT_PCR from poplar (Populus×euramericana cv. “74/76”) developing second xylem mRNA. It was cloned into pGEM-T Easy vector and identified by restriction enzyme, PCR amplification and sequencing. The sequence of the amplified DNA fr...
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 刘俊清  陈立勇  陈尚武  张文  马会勤  
本试验以无花果的根、茎、叶、果作为材料,比较了CTAB法和Trizol法对无花果材料RNA的提取效果。以CTAB法提取的不同无花果材料的RNA为模板,反转成cDNA第一链,通过半定量RT-PCR,研究了植物常用内参基因18SrRNA、Actin和Tubulin的表达量变化。结果表明:CTAB法是适合不同无花果材料的RNA提取法;18SrRNA在无花果不同组织中的表达水平较高,且相对稳定,Tubulin在无花果不同组织中相对表达量较低,且相对稳定,是研究无花果不同组织基因表达水平较为适宜的内参基因。
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 周金林  沈杰  周勇志  石滨海  王云飞  
为了解伊氏锥虫在动物体内抗原变异情况,用伊氏锥虫安徽株克隆虫体 ShTat1分别感染兔和豚鼠。在兔体30d 中,每3d 分离兔血中锥虫并克隆,获得10个克隆锥虫,经间接免疫荧光试验和生物素抗生物素酶标试验鉴定,为9个抗原性互不相同的抗原变异体 ShTat1.1~1.9.同中方法在4只兔体内30d 获得同样9个变异体,并且出现顺序一致,该克隆在豚鼠体内15d 所获得的5个变体,经鉴定均在兔体现出过,
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 丁惠东  汪志楷  沈永林  
在199培养基中补充25.0mmol/L Hcpcs,5.5mmol/LD 葡萄糖,2.0mmol/L 丙酮酸钠,2.0mmol/L L-谷氨酰胺作基础培养基,观察了5种不同因素对体外培养系统中伊氏锥虫生长的影响。结果表明:5%~20%灭活马血清、20%灭活犊牛血清或20%灭活驴血清都能较好地维持伊氏锥虫在体外生长;牛肺成纤维细胞或小牛胸腺成纤维细胞能够作为饲养层细胞使用,一代细胞使用期分别是15d 和20d;培养基中加入青霉素(150μg/ml)和链霉素(250μg/ml)对虫体生长影响极显著(P<0.01),每毫升培养基中的含虫量与不加青、链霉素者相比低4.0×10~5左右;2巯基乙醇(2...
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 丁惠东  汪志楷  沈永林  
以199培养基添加25.0mmol/L Hepes,5.5mmol/L D 葡萄糖,0.2mmol/L 2-巯基乙醇,2.0mmol/L 丙酮酸钠和2.0mmol/L L 谷氨酰胺为培养液,并加20%的灭活马血清,分别以牛肺成纤维细胞和小牛胸腺成纤维细胞为饲养层细胞组成两种组合;或以同样的培养液改加20%灭活犊牛血清或20%灭活驴血清,以牛肺成纤维细胞作为饲养层细胞组成另两种组合。用这4种组合在37℃和烛缸的气相条件下成功地连续培养伊氏锥虫江苏高邮株60d 以上,培养的虫体对小白鼠的感染性和致病力无明显变化。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 谢超  孙恩贵  刘俊华  王祥生  杨发青  
以不同剂量的伊氏锥虫排泄分泌抗原(ESA)对小鼠进行常规免疫,用同株伊氏锥虫攻击,观察并记录小鼠死亡时间、死亡只数,比较免疫后血清抗体水平。结果表明:除对照组和5μg组未产生特异性抗体外,其余各组均产生较高滴度的抗体,其中200μg组为1∶6400,100μg组为1∶3200。ESA50,100和200μg免疫组可对小鼠产生有效的保护,小鼠存活时间较对照组延长2~3倍,以100μg组产生的保护作用最好
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 沈永林  汪志楷  李国清  
体外培养后分离出的3个伊氏锥虫变异群体,经环磷酰胺处理大鼠(CY 大鼠)扩增收虫。虫体纯化后超声波裂解,超速离心制成可溶性抗原,经 Sephadex G-50脱盐和 DE-52离子交换层析提纯可变表面糖蛋白(VSG)。经 SDS-PAGE 鉴定,所提纯的3个 VSG 分子量均为40500。用日立835-50型高速氨基酸组成分析仪分析,3个 VSG 均由 Asp,Pro,Thr,Ser,Glu,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,Arg共17种氨基酸组成,但在组成比例上差异明显,尤其表现在 Pro,Met,Leu,Ile.Tyr 和 Clu。经...
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 蔡建平  汪志楷  沈永林  李祥瑞  潘红杰  
本试验对伊氏锥虫表面的非变异性蛋白(/抗原)进行初步研究.以磺基琥珀酰-6-(生物素胺)-已酸盐(Sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate)对虫体表面蛋白进行生物素标记,超声裂解后经差速离心
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 周勇志  沈杰  周金林  石滨海  王云飞  
锥虫的抗原变异非常频繁,阻碍了免疫学防治技术的建立,国内外虽然对此有较多研究报告,但对中国不同地理、宿主株伊氏锥虫表面变异糖蛋白(VSG)分离和特性比较尚无报道,而我国北方新疆骆驼株伊氏锥虫和南方牛、马伊氏锥虫存在来源、地理、宿主和生化特性的差异,因此我们对这两个虫株的 VSG 进行了分离、纯化和特性比较研究,所用虫株来源于新疆骆驼体内、安徽水牛体内.分离后克隆为单一虫株,经小白鼠、大白鼠体内繁殖,鼠血经过 DEAE-52纤维素层析获得纯净锥虫,再经超声裂解,经过两次超速
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)  [作者] 黄训才  邓子牛  胡春华  焦徕  韩健  谢跃兰  
为建立主要柑橘病毒病准确、快速的分子检测体系,在表现柑橘衰退病(CTV)、柑橘裂皮病(CEV)和柑橘碎叶病(CTLV)典型症状的病树上采叶样提取总RNA进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析.病毒鉴定用的特异引物为CTV3对、CEV2对和CTLV1对.通过不同退火温度的测试,发现所有参试引物均能在56℃退火时扩增出相应的病毒特异带,从而在保证鉴定准确性的前提下,极大地简化了鉴定程序.用建立的RT-PCR体系对云南、重庆、湖南等地有衰退病、裂皮病和碎叶病症状的样品进行检测,结果表明该体系均能对相应病毒进行准确检测.
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