为开发RNAi转基因作物的田间可视化鉴定方法,以DNA嵌合染料SYBR Green I为材料,采用设置重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)特异性引物的手段,建立了一种快速、低成本、可视化的RPA用于转基因大豆‘B5C9123-5’的检测。结果表明,在靶标不存在时,RPA体系中游离的SYBR Green I染料使溶液呈现较弱的黄色荧光。在靶标存在的情况下,RPA扩增产生的双链DNA与SYBR Green I结合导致溶液从黄色转变为绿色并使荧光迅速增强。通过对RPA扩增时间和温度进行优化,阳性结果可在20min内用肉眼鉴别,检测限为1.00ng/μL。通过设置不同RPA引物,该方法可用于现场快速检测多种RNAi转基因作物。

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。

针对大豆色拉油中DNA较难提取的问题提出了充分乳化、延长醇沉淀时间和反复富集小片段DNA等措施,有效地从大豆色拉油中提取到DNA,并通过大豆特异内源基因扩增得以证明。从两个不同品种商品大豆色拉油中检测出35S启动子和NOS终止子外源调控序列,并通过增加所用DNA模板用量检测出目的基因EPSPS序列,建立了大豆色拉油中转基因成分检测方法。

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNASYBRGreenI结合染料实时荧光定量PCR技术,扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因,绘制2种基因扩增的循环数拷贝数标准曲线图,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量;并作重现性和熔解曲线分析。结果表明,lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好,R2值分别达到0.9997和0.9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示,实测值与实际值接近,相对偏差5%～11%。SYBRGreenI实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已获得中国进口加工原料安全证书，建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR）检测方法，为抗逆大豆IND-??41?-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-??41?-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针，结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针，随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选，遴选出1对候选引物探针；设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度，优化qPCR方法的反应体系；设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性；以纯合抗逆大豆IND-??41?-5基因组DNA作为标准样品，梯度稀释成标准溶液模板，绘制标准曲线，考察qPCR方法的线性动态范围，配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品，评价定量方法的准确性；配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品，测试方法的检出限；拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试，确定方法的定量限；最终确定抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证，采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性，利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合，建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性qPCR方法，扩增片段为138 bp，优化的反应体系引物终浓度为0.4μmol·L~(-1)、探针终浓度为0.2μmol·L~(-1);IND-??41?-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33—83 190 copies的基因组DNA，该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-??41?-5测试样品，偏差和相对标准偏差（RSD）均小于25%；确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强，检出限为0.05%，定量限为0.1%，且具备良好的实验室间重复性和再现性，经测量不确定度预评定后，获得5份抗逆大豆IND-??41?-5测试样品的测量结果分别为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，能够实现抗逆大豆IND-??41?-5转化体成分的精准定量检测。

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1...

为实现转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’转化体成分的精准定量检测,以转基因大豆‘ZH 10-6’的5′端边界序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针浓度进行优化,经特异性测试,建立了耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’的微滴式数字PCR检测方法。结果表明:1)特异性良好:只有以转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’基因组为模板才有扩增信号;2)灵敏度高:在相对标准偏差≤25%的情况下,方法的检出限(LOD)为13.0个拷贝;定量限(LOQ)为66.0个拷贝;3)PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R2>0.99,DNA含量线性范围为0.08%～100.00%。综上,本研究建立的转基因耐除草剂大豆‘ZH 10-6’转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高,可用于对转基因大豆品种‘ZH 10-6’的定量检测。

【目的】DNA的提取是GMO(Genetically modified organism)作物检测中重要步骤,DNA的质量关系到GMO检测的成败。【方法】本研究以大豆油为材料,探索出一种快速、简便的提取大豆油DNA的方法。【结果】该方法能从10ml大豆油中提取0.4μg高纯度DNA,可用于PCR检测。提取市场上出售的十几种精练大豆油的DNA,针对35S、Nos、EPSPS和Lectin基因进行了PCR检测,分别扩增出不同的目的片段。【结论】大豆油中有残存的DNA碎片,在转基因大豆油中能扩增出外源基因的片段。本研究为大豆油的外源基因的检测提供了可行方法。

将转基因大豆、玉米和水稻的主要外源Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因和内参RBCL基因目标片段分别克隆到克隆载体pMD18-T中,构建获得的质粒可作为定性检测3种转基因粮食作物的上述外源基因的通用标准分子质粒pMD18-T-PAT-CP4-EPSPS-Cry1 A(B)-BAR-RBCL,长约4.7 kb。经过双酶切、测序及PCR扩增,获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的标准分子质粒是正确的,可以用来作为不同品种转基因粮食作物定性检测CP4-EPSPS基因、Cry1 A(B)基因、BAR基因和PAT基因的通用阳性标准分子。

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系，将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要，本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法，以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数；基于基因组重测序技术，采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点，插入方式为反向插入；结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列，基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列，方法快速、结果可靠，为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成...

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg...

【目的】从大豆盐胁迫基因表达谱中筛选并克隆得到同源异型域亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip)家族基因GmHAT5,将其转化豆科模式植物百脉根并进一步探究其抗盐调控机制。【方法】使用多种生物信息学软件对GmHAT5的开放读码框(ORF)、编码蛋白的分子量、等电点、序列结构和蛋白定位等进行预测,同时将大豆GmHAT5蛋白与其他10个物种的同源蛋白进行比对分析,并对GmHAT5在大豆不同器官及盐胁迫下的表达特性进行分析。此外,构建GmHAT5的植物超表达载体,通过对发根农杆菌LBA1334的转化,得到"复合体"百脉根

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。