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[期刊] 水产学报
[作者]
夏立群 梁海鹰 张红莲 秦启伟
新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP4...
[期刊] 水产学报
[作者]
夏立群 张红莲 秦启伟
新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒,可导致石斑鱼死亡率达90%以上,给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因,可能参与细胞的生长调控,并对病毒复制有重要作用。在SGIV ICP46序列中存在一段富含亮氨酸(Leucine,L)的潜在核输出信号(nuclear export signal,NES)。为了深入研究该段NES序列在SGIV ICP46核转运过程中的作用,实验构建了3个NES缺失的突变体:仅含NES之前片段的突变体(ΔNESa)、仅含NES之后片段的突变体(ΔNESb)...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
夏立群 张红莲 梁海鹰 刘森林
新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优...
[期刊] 水产学报
[作者]
王著希 周胜 黄友华 王劭雯 黄晓红 周永灿 秦启伟
在病毒感染宿主细胞过程中,病毒利用宿主细胞骨架如微丝、微管等完成进入、运输和释放等过程。为分离鉴定石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白,实验应用去污剂溶解病毒囊膜,然后结合1-D-SDS-PAGE切胶分离和LC-MS/MS质谱鉴定两种方法进行检测,除了病毒编码的囊膜蛋白外,还发现7种宿主细胞来源的蛋白,包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin等,由此推测这些宿主蛋白是与病毒纯化过程中共纯化获得。鉴于actin在病毒感染中发挥着重要的作用,进一步通过蛋白印迹、免疫电镜实验验证了actin与病毒共纯化,揭示actin是一
[期刊] 水产学报
[作者]
潘莹 杨家辉 彭发永 黄友华 秦启伟 黄晓红
为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法，本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针，建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度，在40.1°C恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测，最低检测限为10~2个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42°C恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现，最低检测限为10~1个/μL标准质粒，且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应，临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV，两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点，在临床应用具有较好的应用前景。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张星朗 高志 杨平凹 周小愿 贾秋红 韩亚慧 高宏伟
为研制基于杆状病毒表达系统的大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)新型亚单位疫苗,将CGSIV主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因克隆至杆状病毒穿梭载体p Fast Bac1质粒中,构建了重组质粒p Fast Bac-MCP。转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经PCR筛选和测序获得了阳性重组杆粒r Bacmid-MCP,在昆虫细胞转染试剂介导下将该重组杆粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染
[期刊] 水产学报
[作者]
关丽雅 黄友华 蔡佳 黄晓红 秦启伟
新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖产业严重经济损失的主要病毒病原之一。SGIV是大分子DNA病毒,包含162个基因开放阅读框,其中ORF050是一个肿瘤坏死因子受体类似物,可能在SGIV的免疫逃避中发挥作用。本研究克隆了SGIV ORF050基因,并构建了全长基因的真核表达重组质粒和四个半胱氨酸富集结构域(CRD)分别缺失的突变体。RT-PCR和药物抑制实验结果表明,SGIV ORF050是病毒的一个立即早期基因。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞质内均匀地弥散性分布,并在细胞核周围聚集;第一个CRD缺失后,基因的定位发生明...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘泽天 张馨 黄晓红 黄友华 秦启伟
为评估石斑鱼养殖过程虹彩病毒病发生的风险，本实验结合Delphi法和层次分析法（analytic hierarchy process， AHP），构建石斑鱼虹彩病毒病发生的风险评估模型。其中，风险因素评估指标体系包括1个目标层石斑鱼虹彩病毒病发生风险(水质、石斑鱼健康状况、饲养管理、养殖模式和养殖环境)和20个指标层风险因素(水温、PH、溶氧、氨氮、病毒感染、细菌感染等)。准则层风险因素权重值集合为W={0.129 8，0.367 2，0.173 3，0.032 7，0.297 1}，指标层风险因素中病毒感染（0.248 5）、邻近区域发病情况（0.138 4）、水温（0.112 3）和养殖密度（0.105 0）等权重值较高，推测它们是影响石斑鱼虹彩病毒病暴发的高风险因素。进一步实验室模拟感染实验结果表明，养殖密度、病毒感染剂量及养殖温度均明显地影响鱼体内新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的复制及实验鱼死亡率。上述结论和评估模型中推定的高风险因素相吻合，说明该模型可用于石斑鱼养殖过程中虹彩病毒病发生的风险评估。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙莹 李俊平 黄小洁 李岭 曹明慧 李启红 李慧姣 杨承槐
【目的】鸭肠炎病毒（ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ｄｅｖ）不同毒株间存在明显差异，ｄｅｖ疫苗株的ｕＬ２基因在１９５ｂｐ后连续缺失５２８ｂｐ，导致第６５位氨基酸后连续缺失１７６ａａ～（［１］）。将绿色荧光蛋白（ＧＦｐ）基因插入ｄｅｖ ｕＬ２基因中，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒，以研究ｕＬ２基因对ｄｅｖ生物特性的影响和探讨ｄｅｖ作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的ｄｅｖ细胞适应株ｄｎａ为模板，利用ｐｃｒ技术扩增出病毒ｕＬ２基因上下游序列并克隆入ｐＭｄ－１８ｔ载体；以ｕＬ２基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂，将ｃＭｖ启动子控制的含有ＧＦｐ－Ｇｐｔ基因表达盒克隆入ｄｅｖ．．．
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘丽华 沈卫德
将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。
关键词：
绿色荧光蛋白 秋黏虫细胞 基因表达
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
苏胜彦 陈为先 马佳璐 张勇 胡鹏晨 闻剑旻 张成锋 董在杰 袁新华 徐跑
以水母绿色荧光蛋白基因为模板进行PCR扩增得到目的基因(Green fluorescence protein,GFP),然后加上酶切位点BamHI和NheI,构建pLenti6.3-IRES-EGFP载体,转染DH5α感受态细胞进行菌落PCR,取阳性进行酶切鉴定,再取呈阳性的质粒进行测序,使用浓度为1μg/μL的质粒与慢病毒表达载体进行连接,通过荧光显微镜观察到绿色荧光,表明本实验获得的GFP和慢病毒载体整合成功;用此转染293T细胞,通过荧光显微镜同样检测到了绿色荧光。使用建鲤的组织提取RNA,然后按照Fermentas公司的M-MLV操作说明书进行反转录,得到IGF2b基因后加酶切位点进行...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴成龙 史成银 黄倢 孔晓瑜
依据大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot viral reddish body iridovirus,TRBIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列,设计了一对特异性引物,并在正反向引物中分别引入EcoR I和Not I酶切位点,从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点,并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR I和Not I双酶切以及测序分析,构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MC...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
芮荣 邱妍 胡元亮 范必勤
以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的载体 ,对处于快速增殖期的 8株猪胚胎生殖 (EG)细胞 (4～ 9代 )进行转基因试验。用 1μgDNA和 2 μLLipofecTamine 2 0 0 0转染EG细胞后 ,共获得 4株转染EGFP基因的EG细胞系 (EG EGFP) ,可发出强绿色荧光 ;EG EGFP细胞连续培养 2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中 ,共注射 135枚胚胎 ,其中 112枚存活并发育至囊胚 (83 0 % ) ;86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞 ,其中 5 7枚囊胚在内细胞团 (ICM)上发现有E...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
秦蕾 王印庚 史成银 张正 张立敬
对我国虹彩病毒感染的大菱鲆Scophthalmus maximus进行的组织病理和超微病理学研究发现,该病典型的病理学特点是在病鱼的脾脏、肾脏、肠、肝脏、鳃、心脏和皮肤等器官组织内出现嗜碱性的肿大细胞。病毒感染导致患病大菱鲆多个器官组织发生了不同程度的病理变化,其中以脾脏组织的病理变化最为显著,表现为造血组织的严重坏死。此外,肾脏造血组织发生坏死、肠固有膜和黏膜下层出血和水肿、肝细胞水样变性、心肌局灶性坏死以及皮肤真皮层出血并伴有水肿和炎性渗出也是该病常见的组织病理学变化。超微病理研究表明,肿大细胞内有虹彩病毒粒子存在。病毒分布于受感染细胞的胞质、组织间隙以及血管腔内。受感染细胞出现线粒体和内...
关键词：
大菱鲆 虹彩病毒 病理学 肿大细胞
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘洋 沙珍霞 陈松林 隋少飞 徐美瑜
通过显微注射的方法,将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因注射入花鲈(Lateolabraxjaponicus)单细胞期受精卵动物极细胞质内。初步研究了显微注射后的花鲈胚胎的存活状况。在荧光显微镜下观察到了GFP的表达,多数胚胎表现为嵌合性表达。利用PCR技术,从花鲈尾芽期胚胎DNA中扩增出了特异片段,大小为750bp,表明显微注射胚胎中整合了外源GFP基因。
关键词：
GFP 花鲈 显微注射 转基因
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