用摩尔比100∶1的化学交联剂SPDP分别将RPE、抗猪瘟病毒抗体衍生,两种衍生物再以摩尔比1∶1液相交联,HPLC纯化制备出RPE标记的抗猪瘟病毒荧光抗体。对制备的荧光抗体从荧光特性、抗体活性、稳定性及纯度等方面进行鉴定。以溴化氰活化的琼脂糖微球为固相载体,采用固相免疫荧光检测法,以制备的RPE、FITC分别标记的荧光抗体检测猪瘟病毒细胞毒。结果表明,RPE标记的荧光抗体检测阳性微球在蓝绿光激发下发射桔黄色荧光,荧光明亮,无本底光干扰,检测灵敏度高达2.67×10-6mg.mL-1,是FITC标记的荧光抗体检测灵敏度的10倍。RPE可替代FITC或与FITC等荧光染料一起用于多色荧光免疫检测...

用适宜摩尔浓度的异型双功能交联剂SPDP将R-藻红蛋白与纯化的禽流感病毒H9亚型多克隆抗体交联,并经高效液相色谱纯化制备R-藻红蛋白标记抗体荧光探针。以溴化氰活化的琼脂糖微球为固相载体,采用双抗体夹心法建立固相免疫荧光检测法,以制备的R-藻红蛋白标记抗体荧光探针检测禽流感病毒H9尿囊毒。结果表明,阳性微球在蓝、绿光激发下发射桔黄色荧光,荧光明亮,无背景光干扰,特异性好,灵敏度高,可检测蛋白浓度为1.85×10-5mg.mL-1的H9亚型尿囊毒。R-藻红蛋白标记探针的检测灵敏度高于FITC标记探针,R-藻红蛋白可替代FITC或与FITC等荧光染料一起用于多色荧光免疫检测。

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法。用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7,C9,G10)亚类。经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1∶1 600~1∶3 200,腹水效价为1∶51 200~1∶102 400。交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定...

[目的]本文旨在研究大肠杆菌表达的猪瘟病毒(CSFV)荧光抗体用于病毒直接免疫荧光检测的可行性。[方法]在基因水平上对编码猪瘟病毒纳米抗体(VHH)与绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因进行密码子优化,优化后的融合基因插入p ET32a(+)载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达。表达的融合蛋白经过SDS-PAGE、Western blot进行表达及可溶性鉴定。利用镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,经浓缩后用于猪瘟病毒直接免疫荧光检测并与CSFV间接免疫荧光试验进行效果比较,将该荧光抗体孵育CSFV、伪

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位，为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原，免疫6—8周龄BALB/c雌鼠，每两周免疫1次，共免疫3次，首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫，第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化，3次免疫后1 w断尾采血，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫，3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4:1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆纯化，直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞，以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜，分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行Western blotting分析，筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因，其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体，p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体，原核表达部分重叠的截短p30蛋白，最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原，以5株MAbs为一抗，以兔抗鼠HRP-IgG为二抗，通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示，5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA试验呈阳性；Western blotting结果显示，5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应，与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达，而GST-p30bc仅以包涵体形式表达，以两组截短体融合蛋白为包被抗原，通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合，证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域，即第120—153位氨基酸；MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合，证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域，即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白，制备了5株p30 MAbs，定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA，可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。

[目的]本试验旨在制备特异性鼠抗猪瘟病毒(CSFV)非结构蛋白NS3和NS5B的多克隆抗体。[方法]根据CSFV NS5B基因序列设计1对特异性引物,以CSFV石门株为模板PCR扩增NS5B基因,同时根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性优化了NS3密码子,并将NS3和NS5B基因分别克隆至原核表达载体p Cold I,转化至大肠杆菌Rossetta 2(R2),经0. 1mmol·L-1IPTG诱导后进行融合蛋白的表达和纯化,常规免疫BALB/c小鼠制备抗血清。应用Western blot和间接免疫荧光技术鉴定了多克隆抗体的特异性。[结果]Western blot结果显示,该抗血清不仅能识别原核和真核表达的NS3和NS5B蛋白,也能识别细胞中感染的CSFV并产生特异性条带;间接免疫荧光检测结果表明,2种抗血清除均能与胞浆中的CSFV粒子发生反应外,也能识别宿主细胞中真核表达的NS3和NS5B蛋白。[结论]本试验成功表达了NS3和NS5B,且用其制备的抗血清具有生物学功能,为深入探究猪瘟病毒致病机制奠定了基础。

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现，对养猪业造成了巨大危害，损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF，于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体，建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30，通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白，以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株；对P30蛋白进行截短表达，利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位；并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证，结果显示构建出重组载体pET-28a-P30，经测序其序列未发生突变；IPTG诱导后，P30重组蛋白主要表达在包涵体中，分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠，3次免疫后，小鼠血清效价达到1:102 400，说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆，获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞，Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点；截短表达P30蛋白不同片段，选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应，显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化，成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法，检测了190份临床样品，并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比，两方法阳性符合率为90.91%，总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白，经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株，抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高，敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法，为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．

【目的】以鼠肝细胞为模型,在细胞水平上研究猪生长激素抗独特型抗体的作用机制。【方法】以猪生长激素单克隆抗体1A5-F(ab′)2部分免疫BALB/c鼠,采用杂交瘤细胞技术制备猪生长激素抗独特型单克隆抗体。分离Wistar大鼠肝脏细胞,以其为模型,采用流式分析、激光共聚焦显微镜观察、Western-blot等技术手段,研究猪生长激素抗独特型单克隆抗体的生物活性。【结果】成功制备了3株猪生长激素抗独特型单克隆抗体,分别命名为CG1、CG2、CG3。其中,CG1阳性信号最强,经鉴定,CG1为Ab2β类抗独特型抗体,属于IgG2a亚类。CG1能够以二聚体的形式激活鼠肝细胞表面的生长激素受体,并可激活信...

为了检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)抗体,本试验建立了快速、敏感的ELISA诊断方法.通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等4种方法纯化PCV2抗原的包被效果,来确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法,在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA稀释倍数的确定、待测血清稀释倍数的确定、封闭液浓度的确定、封闭时间的确定、HRP-SPA反应时间的确定、临界值的确定、特异性测定、重复性测定、符合率比较等,进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法.结果表明:对猪的多种病毒阳性血清进行ELISA检测,只有PCV2阳性血清呈阳性;对6份血清进行4次...

建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测。用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法。ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10...

【目的】制备猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体,并对其进行鉴定和应用。【方法】以超离纯化的猪圆环病毒Ⅱ型作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为8-60和10-48,对其生物学特性进行鉴定,并将其作为一抗,建立了间接免疫荧光诊断方法。【结果】8-60和10-48的染色体数平均为98～105对,间接ELISA检测其细胞培养上清液效价分别为1∶16和1∶32,小鼠腹水效价分别为1∶3×212和1∶3×213,抗体的免疫球蛋白亚型均为IgM。间接免疫荧光结...

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。