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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张婷婷 辛颖 张志强 任充华 杨涵江 王令 张智英
【目的】构建在小鼠水平上实现多个目的基因的表达以及标记基因安全删除的转基因载体。【方法】以载体为模板,分别扩增SV40P neo、IRES、tk-PloyA,通过overlap PCR连接,并在两端添加方向相同的LoxP序列,构建转基因基本载体PB-NIT;然后通过overlap PCR扩增获得Tet-CMV-SV40 T-T2A-p 53-PolyA基因表达盒,将其插入PB-NIT中,构建载体PB-NIT-STP;最后将转录因子激活域rtTA通过同尾酶连接插入PB-NIT-STP,构建载体PB-rtTA-NIT-STP。【结果】经酶切和测序等鉴定,以上载体均正确;经转座活性鉴定,共转染转座子...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨宁 昝林森 成功 付常振 李耀坤
【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
钟伯雄 危浩 庄兰芳
综述了基于piggyBac转座子的转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的3个关键环节:(1)外源目的基因高效插入家蚕基因组;(2)转基因家蚕的高效、快捷的检测;(3)具有生物活性的外源目的蛋白的高效表达和纯化。同时介绍了有关转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的研究进展,为更好地利用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白提供了参考。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
沈丹 谢雨琇 李庆平 薛松磊 史云强 王赛赛 陈才 钱跃 高波 崔恒宓 宋成义
【目的】转座子(transposon,Tn)是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty(SB)、piggy Bac(PB)和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol23种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至p T2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
白丁平 方堃 杨明明 屈雷 陈玉林
【目的】构建piggyBac(PB)转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含...
[期刊] 水产学报
[作者]
胡莹莹 郭学双 周阳 曹广力 贡成良 薛仁宇
为了探讨piggyBac转座子在鲤科鱼类及鳅科鱼类转基因中的适用性,实验通过将PAβ启动子控制的DsRed表达元件插入pigA3GFP中,构建转基因载体pigA3GFP-AβDsRed。用该载体对草鱼肾脏(CIK)细胞转染,结果显示,通过piggyBac转座子可将外源基因导入到CIK细胞的基因组中,来源于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的CMV启动子在CIK细胞均具有活性。将转基因载体pigA3GFP、pigA3GFP-AβDsRed分别与辅助质粒helper-pigA3混合后以精子介导法导入金鱼和泥鳅的受精卵后,经荧光观察、PCR鉴定、Dot blotting鉴定,证实获得了转基因金鱼和转...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
闫学春 钟莎莎 徐鹏 邹曙明 孙效文
卵泡抑素(follistatin,Fst)蛋白具有拮抗TGF-β超家族许多成员的功能,通过直接的蛋白结合可抑制肌肉抑制素(myostatin)的活性,从而恢复肌肉的生长,表现出增肌效应。参照鲤高通量转录组测序数据的拼接结果,筛选出鲤卵泡抑素Fst1基因的编码框(ORF)序列(全长1 260 bp,编码320个氨基酸),构建了包含金鱼Tgf2转座子左臂(220 bp)、右臂(185 bp)、斑马鱼Mylz2启动子和鲤Fst1基因ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ccfst1。通过显微注射方法,并在体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA的介导下,获得了一批转鲤Fst1基因的转基因鲤。经PC...
关键词：
Tgf2转座子 Fst1 鲤 转基因效率
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
王瑶 蒋霞云 邹曙明
鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的PiggyBac(PB)转座子已用于模式生物小鼠的转基因及插入诱变研究,目前,该转座子在养殖鱼类中的转基因效率如何还不清楚。构建了带PiggyBac转座子左臂、右臂、EF1α启动子和绿色荧光蛋白(eGFP)编码框的pPBs-EF1α-eGFP供体质粒。以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL体外转录的PB转座酶mRNA共同显微注射入团头鲂(Megalobrama amblycephala)1~2细胞期受精卵中,团头鲂eGFP的荧光表达率可达58.26%,PCR检测结果显示,该转座系统在团头鲂成鱼基因组中的整合效率为53.04%。表明P...
关键词：
PiggyBac转座子 团头鲂 转基因
[期刊] 西南农业学报
[作者]
覃鸿妮 谢钰珍 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
马春红 李秀丽 张红心 董文琦 戴志刚 王立安 贾银锁
以2对同核异质玉米B37和Mo17叶片的原生质体为试材,并将原生质体随机分为4组,HMC毒素质量浓度分别为0、50、100、150μg/mL,处理时间分别为1、3、6h。采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光复染的方法进行检测,观察处理后原生质体的凋亡特征及细胞凋亡率的变化趋势。结果表明:HMC毒素处理玉米原生质体后发生细胞凋亡,并出现凋亡小体、染色质边集或环状染色质等凋亡特征;经不同浓度HMC毒素处理B37和Mo17玉米原生质体,CB37的最大凋亡率为10.80%,NB37为4.90%,CMo17为21.00%,NMo17为8.83%;HMC毒素对2种基因型的C、N细胞质所测结果一致,均为...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪开毓 耿毅 黄小丽
采用含200 mg.kg-1喹乙醇的饲料连续饲喂鲤鱼(Cyprinus carpioLinnaeus),分别于饲喂后的第7天、14天、20天、25天和第30天各剖杀4尾鱼,取肝组织,用流式细胞仪检测其细胞凋亡程度。结果显示,在肝细胞DNA直方图中,于G1峰之前出现一AP峰,且AP峰峰值随染毒时间的延长而升高,肝细胞在不同时期的凋亡率与染毒时间呈正相关。在经喹乙醇染毒第7天,鲤肝细胞的凋亡率平均值为2.05%,而对照组为1.70%,两组间差异不显著(P>0.05);在第14天,可见轻微的AP峰;在第20天,凋亡率达到9.49%,凋亡峰已较明显;在第25天时的AP峰比第14天时峰值明显升高;在染毒...
关键词：
流式细胞术 喹乙醇 细胞凋亡
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨志如 云锦凤 魏建华 徐春波
为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草——苜蓿的抗寒性的改良作用,试验从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中利用PCR方法分离了CBF1基因及其启动子,分别构建了CaMV 35S启动子和来源于拟南芥的CBF1启动子驱动的农杆菌介导的植物转化表达载体,为下一步研究利用CBF1基因改良苜蓿抗逆性奠定了基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邱元 黄复深 陈尔曼 郝知友 袁鑫
为探讨粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对猪瘟病毒E2基因核酸疫苗小鼠免疫应答诱导的影响,将CSFVE2基因和GM-CSF片段插入真核表达载体pcDNA3.0内构建pcE2,pcE2-GF及pcGF核酸疫苗.动物试验时,50只雌性供试小鼠随机分为5组,即pcE2,pcE2-GF,pcDNA3.0,pcGF,生理盐水组,每组10只.0,2,4周于小鼠左后肢胫前肌进行肌注免疫,质粒量为每只每次50μg.每次免疫前和末次免疫后2周尾静脉采血收集血清,ELISA检测血清内特异性IgG水平.末次免疫后1周每组随机选3只无菌取脾,MTT法检测淋巴细胞增殖情况.结果表明,与对照组比较,pcE2和p...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘建忠 敖敬 田为宇 周卫 鲁礼林 张晓龙
通过设计1对PCR引物(上游引物,5-′GCCATATGGTGCCGATCCAAAAAG-3′,下游引物,5-′GAGAATTCCCTTCAAGGCCTCAG-3′),采用PCR方法扩增出人肥胖基因编码成熟肽的核苷酸序列,将扩增产物从琼脂糖凝胶上回收后插入测序载体pMD-18-T后进行了核苷酸序列测定。将经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的扩增产物插入经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a(+),构建了可在大肠杆菌中高效表达人瘦蛋白的表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌菌株BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明构建的人肥胖基因表达载体得到高效表达,重组蛋...
关键词：
人肥胖基因 原核表达载体 诱导表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
丛丽君 王滨 段艳欣 吴军帅 冯静
为构建桃果胶乙酰酯酶(PpPAE)基因的原核表达载体pET-32a(+)-PpPAE,并获得稳定高效表达的重组蛋白,以青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室前期获得的PpPAE基因(GenBank登录号KF017595)序列为依据,设计引物并扩增其cDNA片段,重组到原核表达载体pET-32a(+)中,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果表明,已成功构建原核表达载体pET-32a(+)-PpPAE,重组质粒在0.1 mmol/L IPTG浓度下诱导4 h后,有大量融合蛋白表达,分子量约为64 kDa。为进一步研究该蛋白的...
关键词：
桃 果胶乙酰酯酶 原核表达
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