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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
康磊 刘珂 王建忠 尹才 邱亚峰 魏建超 李蓓蓓 邵东华 李宗杰 粟硕 马志永
[目的]本次试验探究PRRSV＿Nsp4基因是否在抑制β2M分子表达方面发挥关键性作用，为进一步研究PRRSV对抗原递呈的免疫抑制机制打下了基础。[方法]本次试验首先建立了PRRSV的反向遗传平台，并成功拯救出PRRSV野生毒株SH2020。随后根据之前对Nsp4基因不同结构域的研究以及氨基酸位点功能预测，在其Domain II和Domain III区域分别筛选了3个和5个不同的氨基酸位点，并在病毒感染性克隆质粒上对这些位点进行不同的氨基酸替换突变，随后将构建好的感染性克隆质粒转染Marc-145细胞以拯救各个Nsp4突变PRRSV病毒。最后将拯救的PRRSV病毒以MOI=0.02感染PAM细胞，并通过RT-qPCR和Western blot验证PRRSV＿Nsp4基因是否能够在PAM细胞β2M分子表达方面发挥的作用。[结果]只有D2-5重组PRRSV毒株在不影响病毒复制能力的同时能够高效的在Marc-145和PAM细胞上促进β2M分子的表达，而野生毒株SH2020表现出了对β2M分子表达的抑制作用。[结论]Nsp4基因在PRRSV抑制细胞β2M分子表达方面发挥重要作用，并且Nsp4＿A80L突变能够显著促进β2M分子的表达。
关键词：
Nsp4 β2M 反向遗传平台 突变毒株
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵孟孟 冯丽丽 冯松林 马红芳 张二芹 王文佳 邢星 张雅 冯嘉萍 张桂红
为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强、弱毒株的Nsp9基因对PRRSV复制的影响,构建含有PRRSV XH-GD强毒株、CH-1R弱毒株Nsp9全长基因的质粒p IRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD、p IRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R,并将重组质粒分别转染到Marc-145细胞中,以MOI=1的剂量接种PRRSV XH-GD毒株,通过TCID50试验测定病毒的滴度,采用荧光定量PCR和Western Blot方法来测定病毒的N蛋白表达情况。结果表明,转染弱毒株CH-1R Nsp
[期刊] 西南农业学报
[作者]
马利宏 肖一红 吕军华 王伟伟 董施伟 周恩民
本研究分别扩增从"高热病"猪体内分离株(TA-12)及美洲经典株ATTC-VR2332 PRRSV Nsp2基因的高变区,亚克隆至表达载体pET-28a中,转化至E.coliBL21中,在IPTG的诱导下进行表达。用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行鉴定。表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,对其免疫原性进行研究。建立了以纯化的重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA,确定了临界值,用建立的ELISA方法并对400份猪血清进行了检测和应用。结果表明,成功的表达了分离株TA-12及ATTC-VR2332 Nsp2基因的高变区。表达蛋白纯化分别免疫小鼠后,获得多克隆抗体,其抗体效价...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤 董建宝
为了弄清2007年发生于广西一些县市猪场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和其他疾病的混合感染情况,从广西7个县市发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场采集病料,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)及猪瘟病毒(CSF)检测,并对检测的PRRSV进行分子病原学分析。结果显示,经PCR检测,86份样品中有60份为PRRSV阳性,36份为PCV阳性,2份为CSF阳性,说明发生于广西猪群的PRRSV与PCV共感染情况比较严重。通过PRRSVORF5基因序列比较分析发现,来自广西7个县市不同猪场的PRRSV高度同源,核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,推导编码的氨基酸序列同源性为...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
吴磊 袁旭 洪锦璇 陈叶 李训良 宋中宝
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和马动脉炎病毒(EAV)等动脉炎病毒的Nsp4蛋白在病毒免疫逃逸中的作用，通过免疫沉淀和质谱技术筛选到与Nsp4互作的宿主蛋白mTANK.将pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染HEK293T细胞，发现Nsp4可特异性降解mTANK.为了进一步揭示其中的机制，利用蛋白酶体抑制剂MG-132、凋亡途径抑制剂Z-VAD-FMK、溶酶体抑制剂NH_4Cl和自噬抑制剂3-MA分别处理共转染的细胞，发现这些抑制剂处理并不影响Nsp4对mTANK的降解作用，随后构建了PRRSV Nsp4(E39、E64、E118)和EAV Nsp4(E39、E65、E120)的酶活性突变体质粒.将突变体质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染后发现，Nsp4蛋白酶活性缺失后无法降解mTANK.进一步研究发现，mTANK降解产生的片段分别位于30和25～30 ku附近.综上，PRRSV和EAV的Nsp4蛋白可通过其3C样蛋白酶活性特异性切割宿主蛋白mTANK.
[期刊] 西南农业学报
[作者]
邱洪凯 曹丙蕾 肖一红 周恩民
从猪"高热病"病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(SD-TA株),该病毒能够被抗PRRSV N蛋白单克隆抗体所识别。根据GenBank PRRSV经典株(VR-2332)和变异株(JXA1)基因序列分别设计合成了10对引物,利用RT-PCR扩增其基因序列,分别得到了预期的基因片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNASTAR软件分析,与国内外已发表毒株的序列进行比较。结果显示,与美洲型相比,PRRSV SD-TA株相应基因核苷酸同源性为89.3%~99.1%,并且在Nsp2上缺失了30个氨基酸;与欧洲型代表毒株LV株相比同源性为59.9%。遗传关系表明:SD-TA...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 吴旭锦
【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测，达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，设计并合成了2对引物，通过改变不同的反应体系和反应条件，建立PRRSV经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测，验证建立RTnPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL；且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 吴旭锦
【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测，达到快速诊断的目的。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，设计并合成了２对引物，通过改变不同的反应体系和反应条件，建立ＰＲＲＳＶ经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测，验证建立ＲＴ－ｎＰＣＲ方法的适用性。【结果】建立了ＰＲＲＳＶ经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，该方法检测的ＣＤｎａ含量极限为１．３×１０－７ ＰＧ／μＬ；且仅能从ＰＲＲＳＶ毒株中扩增到目的．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫
【目的】了解陕西及周边省份部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）ＮＳＰ２和ＧＰ５的变异情况。【方法】采用套式ＲＴ－ＰＣＲ方法，从肝、脾、肺和血清中直接扩增ＮＳＰ２、ＧＰ５基因并克隆测序，将获得的ＰＲＲＳＶ流行毒株序列与ＧｅＮＢａＮｋ中３０个ＰＲＲＳＶ参考毒株进行比对分析，构建进化树。【结果】获得了１３株ＰＲＲＳＶ的ＮＳＰ２基因序列（ＧｅＮＢａＮｋ登录号ｋＭ２３３８４９～ｋＭ２３３８６１）和１２株ＧＰ５基因序列（ＧｅＮＢａＮｋ登录号ｋＭ２３３８６２～ｋＭ２３３８７３）。基因进化树分析显示所有测定ＰＲＲＳＶ流行毒株均属北美洲型。对ＮＳＰ２基因序列分析发现，１２株ＰＲＲＳＶ为氨基酸缺失毒株，１．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王凤雪 冷雪 李真光 温永俊 刘准 武华
根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank登录号为EU860248),结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,选择高致病性PRRSV TJ株噬斑克隆纯化前后14个不同代次,利用合成的引物扩增各代次Nsp2基因的高变区片段及F3代和F92代Nsp2全基因,并进行产物克隆和氨基酸序列分析及结构预测。测序结果表明:PRRSV TJ株在克隆传代过程中出现了序列整段缺失,共缺失120个氨基酸,并且从F18代噬斑克隆开始一直稳定存在。缺失高变区及Nsp2蛋白二级结构预测结果表明:缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生了较大的...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
黄泽彬 李润成 尹德明 颜运秋 刘忠华 丁建 汪镇南 余兴龙
从湖南省内多个出现疑似猪"高热病"症状的猪场采集病料70份,采用RT-PCR方法进行分子流行病学调查.结果检出PRRSV阳性病料54份,阳性率高达77.14%(54/70).对其中8份分别来自娄底、浏阳、永州、双峰、益阳、株洲、宁乡和溆浦的病料中的PRRSV基因组Nsp2高变区部分基因片段进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析.与国内外美洲型PRRSV分离株比较,序列相似性为72.2%～100%,其中,与公布的高致病性PRRSV缺失变异毒株的同源性最高,序列相似性为98.2%～100%.序列分析表明,这些毒株均是天然存在缺失的变异毒株,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,分别为编码1个氨基酸的...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张凤华 卢晓艳 徐红运 赵琳 刘玉松 范旭 夏平安 崔保安
为了解PRRSV Nsp2基因缺失变异株的致病性,采用2个Nsp2基因分别连续缺失3个和89个碱基的PRRSV变异株Hn-2(GenBank:FJ237419)和Hn-4(GenBank:FJ237421)的病毒液,人工滴鼻感染断奶仔猪,同时用Marc-145健康仔猪细胞培养液滴鼻作对照,在感染后0,7,14,24,32,41,50,60和70 d无菌采血,分离血清,用RT-PCR方法检测病毒、用N-ELISA方法和免疫荧光抑制试验分别检测抗PRRSV N蛋白抗体和抗PRRSV中和抗体,比较分析不同时期病毒复制和抗体产生的变化规律。结果表明,仔猪感染Hn-2和Hn-4毒株后7～14 d均能检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏春华 刘建奎 戴爱玲 龚丽贞 李晓华 黄思琼 杨小燕
【目的】了解福建省NADC30-like PRRSV FJLY01株的分子生物学特征和遗传演化规律,为PRRSV的防控提供参考。【方法】对采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,以NADC30PRRSV毒株基因序列为参考设计并合成9对引物,分别对分离株序列进行分段PCR扩增,经克隆测序后进行序列拼接,采用MEGA 6.0软件进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制其与其他35株毒株的系统遗传进化树。【结果】FJLY01株基因组全长为15 016bp(不包含polyA),包含10个开放阅读框,5′
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦彬 孙向丽 魏战勇 陈红英 杨明凡 崔保安
【目的】制备复合型猪干扰素α和γ进行应用抗病毒研究。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual,分别置于PH和P10启动子控制下,引入蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达,并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染昆虫细胞,鉴定重组蛋白的活性。【结果】通过间接免疫荧...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张磊 韩明远 王建华 宁宜宝 陈坚
【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞,构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组(Tester),以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交方法,构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库,并使用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验,得到S8、S29、L6、L26及L3...
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