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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈如敬 周伦江 吴学敏 车勇良 王晨燕 王隆柏 黄晓凤 严山 刘玉涛 魏宏
【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李兰 郑其升 张元鹏 李鹏成 肖希龙 付言峰 侯继波
为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PR
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫
【目的】了解陕西及周边省份部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）ＮＳＰ２和ＧＰ５的变异情况。【方法】采用套式ＲＴ－ＰＣＲ方法，从肝、脾、肺和血清中直接扩增ＮＳＰ２、ＧＰ５基因并克隆测序，将获得的ＰＲＲＳＶ流行毒株序列与ＧｅＮＢａＮｋ中３０个ＰＲＲＳＶ参考毒株进行比对分析，构建进化树。【结果】获得了１３株ＰＲＲＳＶ的ＮＳＰ２基因序列（ＧｅＮＢａＮｋ登录号ｋＭ２３３８４９～ｋＭ２３３８６１）和１２株ＧＰ５基因序列（ＧｅＮＢａＮｋ登录号ｋＭ２３３８６２～ｋＭ２３３８７３）。基因进化树分析显示所有测定ＰＲＲＳＶ流行毒株均属北美洲型。对ＮＳＰ２基因序列分析发现，１２株ＰＲＲＳＶ为氨基酸缺失毒株，１．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘项羽 聂庆庆 杜恩岐
[目的]利用大肠杆菌原核表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及在其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap嵌合蛋白,对Cap蛋白形成的病毒样颗粒(VLPs)的稳定性、免疫原性以及C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位VLPs的热稳定性进行研究,为猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs疫苗的高效制备及基于Cap VLPs纳米骨架展示技术嵌合疫苗的开发奠定基础。[方法]采用分子生物学方法合成PCV2b型强毒株ZJ的cap基因,在其C-端插入PRRSV T细胞抗原表位T1、T2、T3、T4、T5,构建cap-T1～cap-T5基因;将cap及cap-T1～cap-T5基因与pET28a表达载体连接,构建重组表达载体,转染大肠杆菌ClearColi~(TM) BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达产物的热稳定性及免疫效果进行检测。[结果]实现了Cap蛋白及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并成功观察到了VLPs;表达产物热稳定性分析显示,在60℃处理30 min条件下,Cap VLPs保持稳定,而C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的VLPs热稳定性大幅下降;小鼠免疫效果检测显示,Cap VLPs诱导产生了高水平特异性抗体,其中VLPs+佐剂S350组效果最好。[结论]利用大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白可高效自组装成耐热和高免疫原性的VLPs,但在Cap蛋白C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位后的嵌合VLPs组装效果和稳定性急剧下降,提示PCV2 VLPs作为纳米骨架用于传染病疫苗研发仍有较大局限性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 吴旭锦
【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测，达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，设计并合成了2对引物，通过改变不同的反应体系和反应条件，建立PRRSV经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测，验证建立RTnPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL；且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 吴旭锦
【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测，达到快速诊断的目的。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，设计并合成了２对引物，通过改变不同的反应体系和反应条件，建立ＰＲＲＳＶ经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测，验证建立ＲＴ－ｎＰＣＲ方法的适用性。【结果】建立了ＰＲＲＳＶ经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，该方法检测的ＣＤｎａ含量极限为１．３×１０－７ ＰＧ／μＬ；且仅能从ＰＲＲＳＶ毒株中扩增到目的．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
康磊 刘珂 王建忠 尹才 邱亚峰 魏建超 李蓓蓓 邵东华 李宗杰 粟硕 马志永
[目的]本次试验探究PRRSV＿Nsp4基因是否在抑制β2M分子表达方面发挥关键性作用，为进一步研究PRRSV对抗原递呈的免疫抑制机制打下了基础。[方法]本次试验首先建立了PRRSV的反向遗传平台，并成功拯救出PRRSV野生毒株SH2020。随后根据之前对Nsp4基因不同结构域的研究以及氨基酸位点功能预测，在其Domain II和Domain III区域分别筛选了3个和5个不同的氨基酸位点，并在病毒感染性克隆质粒上对这些位点进行不同的氨基酸替换突变，随后将构建好的感染性克隆质粒转染Marc-145细胞以拯救各个Nsp4突变PRRSV病毒。最后将拯救的PRRSV病毒以MOI=0.02感染PAM细胞，并通过RT-qPCR和Western blot验证PRRSV＿Nsp4基因是否能够在PAM细胞β2M分子表达方面发挥的作用。[结果]只有D2-5重组PRRSV毒株在不影响病毒复制能力的同时能够高效的在Marc-145和PAM细胞上促进β2M分子的表达，而野生毒株SH2020表现出了对β2M分子表达的抑制作用。[结论]Nsp4基因在PRRSV抑制细胞β2M分子表达方面发挥重要作用，并且Nsp4＿A80L突变能够显著促进β2M分子的表达。
关键词：
Nsp4 β2M 反向遗传平台 突变毒株
[期刊] 西南农业学报
[作者]
马利宏 肖一红 吕军华 王伟伟 董施伟 周恩民
本研究分别扩增从"高热病"猪体内分离株(TA-12)及美洲经典株ATTC-VR2332 PRRSV Nsp2基因的高变区,亚克隆至表达载体pET-28a中,转化至E.coliBL21中,在IPTG的诱导下进行表达。用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行鉴定。表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,对其免疫原性进行研究。建立了以纯化的重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA,确定了临界值,用建立的ELISA方法并对400份猪血清进行了检测和应用。结果表明,成功的表达了分离株TA-12及ATTC-VR2332 Nsp2基因的高变区。表达蛋白纯化分别免疫小鼠后,获得多克隆抗体,其抗体效价...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
夏庆祥 张德庆 吴家强 牛星 王小龙 牛钟相
【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n(2、4、6)串联体,然后分别将P28.n(2、4、6)连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成pcDNA3.1-P28.n(2、4、6)。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n(2、4、6)中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n(2、4、6)重组质粒;提取重组质粒进行双酶...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
黄娟 姜平 李玉峰 蒋文明
【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA(shRNA)的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50%,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著...
关键词：
PRRSV RNA干扰 M蛋白基因
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
吕紫欣 张鑫杰 薛少华 金艳冬 陈林熙 黄喜荣 罗国清 蒙宁 陈瑶 戴爱玲
【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态，为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1 475份临床猪组织和血清样品进行检测，对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序，并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1 172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增，成功获得62株PRRSV ORF5基因序列，并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列，与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示，80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中，40株分布在谱系1(NADC30-like株、NADC34-like株)上，12株分布在谱系3(GM2-like株、QYYZ-like株)上，7株分布在谱系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)上，21株分布在谱系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)上。对核苷酸和氨基酸序列的同源性进行分析，结果显示，80株PRRSV ORF5基因编码的核苷酸序列同源性为81.2%～100%,氨基酸序列同源性为78.6%～100%。33株PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在中和表位区第39氨基酸残基处存在变异。【结论】2020—2022年闽粤赣地区PRRSV流行株以谱系1为主(50.00%),并存在谱系1、3、5、8的混合流行。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王凤雪 冷雪 李真光 温永俊 刘准 武华
根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank登录号为EU860248),结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,选择高致病性PRRSV TJ株噬斑克隆纯化前后14个不同代次,利用合成的引物扩增各代次Nsp2基因的高变区片段及F3代和F92代Nsp2全基因,并进行产物克隆和氨基酸序列分析及结构预测。测序结果表明:PRRSV TJ株在克隆传代过程中出现了序列整段缺失,共缺失120个氨基酸,并且从F18代噬斑克隆开始一直稳定存在。缺失高变区及Nsp2蛋白二级结构预测结果表明:缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生了较大的...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
吴磊 袁旭 洪锦璇 陈叶 李训良 宋中宝
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和马动脉炎病毒(EAV)等动脉炎病毒的Nsp4蛋白在病毒免疫逃逸中的作用，通过免疫沉淀和质谱技术筛选到与Nsp4互作的宿主蛋白mTANK.将pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染HEK293T细胞，发现Nsp4可特异性降解mTANK.为了进一步揭示其中的机制，利用蛋白酶体抑制剂MG-132、凋亡途径抑制剂Z-VAD-FMK、溶酶体抑制剂NH_4Cl和自噬抑制剂3-MA分别处理共转染的细胞，发现这些抑制剂处理并不影响Nsp4对mTANK的降解作用，随后构建了PRRSV Nsp4(E39、E64、E118)和EAV Nsp4(E39、E65、E120)的酶活性突变体质粒.将突变体质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染后发现，Nsp4蛋白酶活性缺失后无法降解mTANK.进一步研究发现，mTANK降解产生的片段分别位于30和25～30 ku附近.综上，PRRSV和EAV的Nsp4蛋白可通过其3C样蛋白酶活性特异性切割宿主蛋白mTANK.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦彬 孙向丽 魏战勇 陈红英 杨明凡 崔保安
【目的】制备复合型猪干扰素α和γ进行应用抗病毒研究。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual,分别置于PH和P10启动子控制下,引入蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达,并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染昆虫细胞,鉴定重组蛋白的活性。【结果】通过间接免疫荧...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李华玮 王旭英 井汇源 万博 乔宏兴 郭科威 侯文静
旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克隆细胞系，体外敲除eIF5A显著抑制PRRSV增殖，这将为进一步探索eIF5A调控PRRSV复制的分子机制奠定基础。
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