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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 吴旭锦
【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测，达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，设计并合成了2对引物，通过改变不同的反应体系和反应条件，建立PRRSV经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测，验证建立RTnPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RTnPCR诊断方法，该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL；且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 吴旭锦
【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测，达到快速诊断的目的。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，设计并合成了２对引物，通过改变不同的反应体系和反应条件，建立ＰＲＲＳＶ经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测，验证建立ＲＴ－ｎＰＣＲ方法的适用性。【结果】建立了ＰＲＲＳＶ经典株和变异株的ＲＴ－ｎＰＣＲ诊断方法，该方法检测的ＣＤｎａ含量极限为１．３×１０－７ ＰＧ／μＬ；且仅能从ＰＲＲＳＶ毒株中扩增到目的．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
秦毅斌 卢冰霞 段群棚 何颖 李斌 梁家幸 苏乾莲 周英宁 蒋冬福 卢敬专 赵武
为建立猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法，根据ＧＥｎ Ｂａｎｋ中公布的ＰＥＤＶ变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的Ｓ基因和ＯＲＦ３基因，设计合成２对特异性扩增引物，用以扩增ＰＥＤＶ Ｓ基因和ＯＲＦ３基因，通过目的片段的数量和片段大小来判断ＰＥＤＶ的毒株类型；通过对退火温度等反应条件的优化，建立了检测不同ＰＥＤＶ毒株类型的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别检测方法。结果显示，所建立的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别检测方法能特异性区分ＰＥＤＶ变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株；ＰＥＤＶ变异毒株扩增出２条目的条带，分别为２３４ ＢＰ的ＯＲＦ３基因片段和８２６ ＢＰ的Ｓ基因片段；ＰＥＤＶ经典毒．．．
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
吕世华 罗秦 刘学军 张福锁
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴玉璐 程群 虞凌雪 侯怡轩 王康 刘光清 童光志 周艳君
【目的】利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95....
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵同科 曹云者 张国印 李广敏
采用多点氮肥单因素多水平试验研究了河北省不同土壤类型不同地力水平条件下,冬小麦拔节期茎基部 NO_3~-含量与产量的相关关系,发现拔节期茎基部 NO_3~-浓度随施肥水平的提高呈直线增加。小麦拔节期茎基部NO_3~-含量与其收获期籽实产量密切相关,在土壤肥力高中低三种不同条件下,相应最高产量分别为 7639,6762,4241 kg/hm~2,最高产量之氮肥施用量分别为 207,194,100 kg/hm~2,相应拔节期植株茎部的 NO_3~-含量分别为1600,1145,671 mg/kg,较好地显示了氮肥的丰缺临界浓度。研究表明,在河北省冬小麦主产区,冬小麦拔节期茎基部NO_3~-含量可以...
关键词：
冬小麦 植株诊断 氮肥推荐 施肥 指标
[期刊] 水产学报
[作者]
李新辉 吴淑勤 李凯彬 白俊杰 潘厚军 罗建仁 简清
从RAPD扩增的鳜鱼病毒 (SCV)核酸电泳带中回收了二个片断 ,克隆子pUC19质粒 (称为SCVE36 9和SCVE45 0 )。序列分析表明插入片段分别为 36 9bp和 45 0bp与GenBank序列没有显著的同源。根据克隆序列设计两对引物P1/ P2 和P3 /P4 ,在健康鳜鱼、病鳜以及提纯的SCV核酸中进行PCR试验。结果表明 ,P1/P2 组引物在SCV基因组中扩增出特异性核酸片段 ,可作为鳜鱼病毒PCR诊断 ,检测片段为 36 9bp。
关键词：
鳜 鳜鱼病毒 多聚酶链反应 快速诊断
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭抗抗 邓力 井勇 张彦明 王晶钰 宁蓬勃
【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐雪 高冬生 王川庆 陈陆 杨霞 皇甫和平 刘慧敏 郑鹿平 杨猛 张金来 李昆明 张九洲
【目的】建立基于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的反转录-复合PCR方法,为IBV流行毒株和呼吸型疫苗株的分型鉴定提供技术支持。【方法】根据IBVN基因序列设计合成1对特异性通用引物,建立IBV的分子生物学检测方法,用以对IBV进行检测。通过对GenBank上公布的IBVS1基因全序列的分析比对,找出呼吸型疫苗株和地方肾型流行毒株相对保守的差异序列,设计合成2对引物,建立可以对这2类IBV毒株进行鉴别的反转录-复合PCR方法,同时对该方法的敏感性和重复性进行检测,并对该方法进行了实际应用。【结果】建立了区别IBV肾型毒株和呼吸型毒株的分型方法,该方法敏感性好,能检出经106稀释后的基因组...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
郑庆礼 吴昊宸 黄瑞玲 许文煌 张誓育 王全溪
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)有多个基因型,其中基因型d的感染率仅次于基因型b,建立PCV-2d基因型的PCR-RFLP诊断方法具有重要意义.根据NCBI中PCV2 Cap基因序列,设计1对特异性引物,并选择PCV-2d特异的酶切位点MSPI进行酶切,对酶切的体系和条件进行优化,同时进行敏感性、重复性试验.结果表明:PCR总体积25μL,模板量2μL,退火58℃,35个循环为PCR反应最佳条件,目的片段702 bp;MSPI酶能将PCV2d特异地切出2个条带474、228 bp.酶切体系为12.5μL、MSPI酶1μL、酶切时间1 h;该酶切体系的最低模板量为10 ng·μL-1,重复性好.送检的24份病料的PCV2d阳性率为33.3%.可见,本研究建立的PCV-2d基因型的PCR-RFLP鉴别诊断方法,特异、敏感.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李建侠 刁有祥 刘霞 李宏梅
【目的】建立快速、准确检测鸭副粘病毒病的方法。【方法】根据GenBank中发表的新城疫F基因序列设计1对引物,扩增鸭副粘病毒融合蛋白基因727bp的特异性片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了鸭副粘病毒病的RT-PCR诊断方法。应用建立的诊断方法,对从山东不同地区分离的20株疑似鸭副粘病毒毒株和150份疑似感染副粘病毒鸭的病变组织进行了检测。【结果】特异性试验表明,建立的RT-PCR检测方法能够从鸭副粘病毒SDFCH株中扩增到727bp的特异性片段,而对鸭瘟病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明,该法最低检出量的cDNA质量浓度为3pg/μL;山东不同地区...
关键词：
鸭 副粘病毒 RT-PCR
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李建华 张西臣 尹继刚 杨举 李德昌
本研究应用聚合酶链反应(PCR)建立了一种检测人及牛粪便中隐孢子虫卵囊 DNA 的方法.以蔗糖梯度离心法纯化鼠源 C.muris 卵囊;甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化牛源 C.muris、牛源 C.parvum 和鼠源C.parvum 卵囊.结果发现甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化隐孢子虫卵囊具有纯度高、回收率达96%、介质便宜及操作简便等优点.纯化卵囊经液氮冻融后按常规法提取 DNA 作为 PCR 模板.根据 GenBank 中C.muris 和 C.parvum 18SrRNA 基因序列,应用计算机辅助设计合成一对 PCR 引物(上游引物:5′-AAACCCAACTTTGCG...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
黄冠军 刘天强 刘衍鹏 饶朝龙 肖丹
根据NCBI公布的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测温和气单胞菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的131 bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为1.0 pg/20μL,对温和气单胞菌的检测灵敏度为50 cfu/20μL。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了温和气单胞菌常规PCR检测体系,该体系可以用于温和气单胞菌的诊断和样品的检测。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张静远 缪发明 陈腾 李敏 扈荣良
【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25μL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃10 s,39℃20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10拷贝/μL,对已知阳性临床组织样品可检至1:103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
邱洪凯 曹丙蕾 肖一红 周恩民
从猪"高热病"病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(SD-TA株),该病毒能够被抗PRRSV N蛋白单克隆抗体所识别。根据GenBank PRRSV经典株(VR-2332)和变异株(JXA1)基因序列分别设计合成了10对引物,利用RT-PCR扩增其基因序列,分别得到了预期的基因片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNASTAR软件分析,与国内外已发表毒株的序列进行比较。结果显示,与美洲型相比,PRRSV SD-TA株相应基因核苷酸同源性为89.3%~99.1%,并且在Nsp2上缺失了30个氨基酸;与欧洲型代表毒株LV株相比同源性为59.9%。遗传关系表明:SD-TA...
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