【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞...

【目的】克隆家蚕（ＢｏｍＢｙｘ ｍｏｒｉ）ＧＡＴＡ转录因子ＢｍＧＡＴＡ６，将其在原核细胞中进行表达，纯化重组蛋白，多次免疫小鼠获得ＢｍＧＡＴＡ６多克隆抗体，为进一步分析ＢｍＧＡＴＡ６在家蚕变态发育中的功能提供抗体条件。【方法】解剖家蚕获得５龄第３天的各组织及４眠至熟蚕整个时期的中肠组织，在液氮中研磨为粉末，利用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ｒＮＡ，体外反转录得到ｃ ＤＮＡ。基于家蚕ＢｍＧＡＴＡ６的基因编码序列设计全长特异引物，并以Ｂｍ ＡｃＴｉＮ３作为内参，进行家蚕５龄第３天各组织及４龄眠期至熟蚕期各时期的ｒＴ－Ｐｃｒ检测。设计原核表达引物，扩增原核表达片段连接到Ｐ ＥＴ３２Ａ载体上，构建原核表达载体，转．．．

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈维氏弧菌V.harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清,建立了5种菌的间接ELISA检测方法,并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示,5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102～107CFU/fish;制备的兔抗血清效价分别为1:2048000、1:16000、1:16000、1:1024000、1:128000;交叉反应结果显示,鳗弧菌、副溶血弧菌、...

采用水溶性碳化二亚胺法 (EDC) ,将MTP与牛血清蛋白 (BSA)、人血清蛋白 (HSA)和鸡卵清蛋白(OVA)共价偶联 ,分别合成免疫抗原MTP BSA、MTP HSA和包被抗原甲胺磷 鸡卵清蛋白 (MTP OVA) ,用合成的免疫抗原对新西兰大白兔进行免疫 ,制得抗血清经鉴定确证为兔抗MTP多克隆抗体 (polyclonalantibody ,PAB) ,效价分别为 1∶15 0 0 0和 1∶12 0 0 0。

【目的】合成并鉴定天名精内酯酮人工抗原，制备天名精内酯酮多克隆抗体，为天名精内酯酮作用靶标的免疫化学定位奠定基础。【方法】通过天名精内酯酮４位羰基和盐酸氨基脲氨基的亲核加成反应制备半抗原天名精内酯酮缩氨基脲（ＣＮ），使用ＭＳ和ＮＭＲ对其结构进行鉴定；采用戊二醛法将半抗原和载体蛋白牛血清蛋白（ＢＳＡ）和卵清蛋白（ＯＶＡ）偶联，合成天名精内酯酮免疫原（ＣＮ－ＢＳＡ）和包被原（ＣＮ－ＯＶＡ），采用紫外吸收扫描法、红外光谱法对免疫原及包被原进行鉴定；用制备好的免疫原免疫健康ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠获得天名精内酯酮多克隆抗体，通过间接非竞争ＥＬＩＳＡ法测定其效价。【结果】成功制备了天名精内酯酮免疫原（ＣＮ－ＢＳ．．．

【目的】探索快速制备高品质X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)多克隆抗体的方法,为研究XIAP基因的功能及XIAP蛋白在肿瘤组织中的表达量检测提供参考。【方法】通过RT-PCR方法获得人XIAP基因的CDs区序列,与pET151/D-TOPO载体连接,构建XIAP基因的原核表达载体;考察细胞密度(OD600)、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对XIAP重组蛋白表达量的影响,以确定XIAP重组蛋白的最佳诱导条件,并用Ni-NTA亲和层析柱法纯化XIAP重组蛋白;用纯化的XIAP重组蛋白对2只成年新西兰白兔进行常规免疫后,再对其中1只进行耳静脉注射加强免疫,连续3d,每天免疫1次,用ELISA检测抗体效...

以纯化harpinxoo蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备兔抗harpinxoo蛋白的多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价为1∶2000,经亲和层析纯化,Westernblot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpinxoo蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpinxoo编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此,兔抗harpinxoo抗体的成功制备,为进一步深入研究harpinxoo的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定基础。

【目的】构建山羊Sox2原核表达载体—pRSET-Sox2,并将诱导表达、纯化的His-Sox2融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备Sox2多克隆抗体。【方法】从pMD18T-Sox2载体上以Bam H I和Xho I双酶切截取Sox2片段,然后将其亚克隆到pRSET-A表达载体上,获得pRSET-Sox2重组质粒。转化了pRSET-Sox2的大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol.L-1 IPTG 37℃诱导4 h,SDS-PAGE电泳及Western blotting检测融合蛋白表达。相同条件下大量增菌诱导,用Ni-NTA argrose介质分离纯化His-Sox2重组蛋白。将体外复性的融合蛋...

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...

为研究草鱼补体蛋白5a (complement component 5a,C5a)、补体蛋白5a受体(C5a receptor,C5aR)和凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，FⅡ)在感染草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)时的蛋白表达和相互作用，针对草鱼C5a和FⅡ蛋白构建了原核表达体系、针对草鱼C5aR蛋白构建C5aR-KLH偶联物，纯化蛋白，免疫日本大耳白兔制备3种蛋白的多克隆抗体。用蛋白质印迹(Western blot)、免疫共沉淀(Co-IP)和拉下(pull down)实验检测3种蛋白表达与互作关系，Western blot结果显示，C5a和C5aR在健康草鱼的肝脏、脾脏、肾脏、头肾、肠、鳃和肌肉中均有蛋白表达，FⅡ在肝脏、脾脏和肠中表达，而在肾脏、头肾、鳃和肌肉中不表达；在感染GCRV的草鱼肝脏组织中C5a、C5aR和FⅡ蛋白均随病程进展呈现上升趋势。Co-IP结果显示，在GCRV处理后，C5a、C5aR和FⅡ蛋白具有相互作用关系。pull down结果显示，C5a pull down共鉴定得到C3、RIG-I等28种候选蛋白，C5aR pull down共鉴定得到转醛醇酶、巨球蛋白等24种候选蛋白。该研究为深入探讨C5a、C5aR和FⅡ互作调控关系以及进一步探索补体和凝血级联系统中3个关联蛋白响应GCRV感染的作用机制奠定了基础。

【目的】制备猪源CD1d的多克隆抗体，为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染过程中的功能奠定基础。【方法】利用PCR方法扩增了猪CD1d基因，并将其同源重组至pGEX-6p1载体中，构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达，表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定，SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带，该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化，将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点皮下注射，免疫剂量为200μg/只，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。三免后第7天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫，一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光（IFA）鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞（PAMs）表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样，制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况，将ASFV接种于PAMs，制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品，以CD1d为一抗，通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒，24 h后收取细胞裂解，加入Flag beads过夜结合蛋白，通过WB检测互作情况染，同时，质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞，用标签抗体对其进行孵育，选择相应的荧光二抗，通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。【结果】原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中，分子质量约为35 ku；实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清，纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带，分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链，且具有较好纯度；该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示，ASFV感染PAMs后，CD1d蛋白表达水平明显增加，并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。【结论】通过原核表达技术制备了CD1d的抗体，为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。

【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的(85—105位)含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(i...

采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果。结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16 mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12 800、IC15为3.41 ng/mL,为建立快速、经济的检测方法打下了基础。

为了获得鸡CD8α/β蛋白及其多克隆抗体,进一步研究其结构与功能,本实验从三黄鸡cDNA文库中克隆了其CD8α/β胞外区片段,构建了pQE30/ChCD8α/β原核表达系统,并经诱导表达、亲和层析纯化,获得了纯化的重组蛋白(rChCD8α/β),然后用rChCD8α/β分别免疫Balb/c小鼠制备了其多克隆抗体。结果表明:本实验克隆的ChCD8α长483 bp、编码161个氨基酸、可在E.coliJM109中高效表达,蛋白质分子质量为24.0 ku,表达量占菌体蛋白量的25.0%,由该蛋白质所制备的多克隆抗体抗rChCD8α的ELISA效价为1∶1 024 000;另外,克隆的ChCD8β长4...