【目的】利用制作的猪的miRNA表达谱芯片筛选猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA,并进一步探讨其中表达差异较明显的miRNA的作用和功能,从miRNA的角度探究CSFV的致病机制,为猪瘟(classical swine fever,CSF)的防控提供新依据。【方法】为了研究CSFV感染PK-15细胞后miRNA表达的变化情况,根据miRBase version 19.0数据库中326条猪的miRNA合成探针,采用原位合成技术制作表达谱芯片,筛选得到CSFV感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA。挑选CSFV感染PK-15细胞后表达差异最明显的miR-214作为进一步研究对象,研究miR-214在CSFV感染过程中的功能和作用。CSFV感染PK-15细胞后,用荧光定量PCR检测miR-214的mRNA表达水平。为了进一步研究miR-214对CSFV感染的影响,合成miR-214模拟物及抑制物,并分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,感染后48h用荧光定量PCR检测CSFV的基因拷贝数,用间接免疫荧光方法检测CSFV的病毒滴度。为了进一步探究miR-214参与调控CSFV复制的机制,通过生物信息学软件预测miR-214参与调控CSFV复制的靶蛋白,并用荧光素酶报告基因系统进一步确证miR-214能够靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1相关的死亡区域蛋白(TNF Receptor-Associated Death Domain,TRADD),因此猜测miR-214通过影响靶蛋白TRADD的表达水平从而影响PK-15细胞凋亡,将miR-214模拟物及抑制物分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,同步设立不感染CSFV的细胞对照,感染后48 h用荧光定量PCR和Western blot分别检测TRADD的mRNA和蛋白表达量的变化,同时用流式细胞术检测miR-214对CSFV感染的PK-15细胞凋亡的影响。【结果】CSFV感染PK-15细胞后,通过表达谱芯片技术筛选得到69条表达有差异的miRNA,其中miR-214表达量上调且差异最明显。qRT-PCR结果显示,CSFV感染PK-15细胞后miR-214的mRNA表达量上调,验证了表达谱芯片的结果。将miR-214模拟物转染PK-15细胞后再感染CSFV, CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著下降;转染miR-214抑制物后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著上升,表明miR-214促进了CSFV的复制。为了进一步探究miR-214促进CSFV复制的机制,用生物信息学软件预测TRADD为miR-214的靶蛋白,荧光素酶报告基因系统验证了miR-214能够靶向作用于TRADD。转染miR-214模拟物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著上升,而转染miR-214抑制物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著下降,表明miR-214抑制TRADD的表达。通过流式细胞术,验证了CSFV感染PK-15抑制细胞凋亡,miR-214抑制CSFV感染的PK-15细胞凋亡。【结论】CSFV感染PK-15后,上调细胞内miR-214的表达。miR-214能通过靶向抑制TRADD蛋白的表达,从而抑制PK-15细胞凋亡,促进CSFV在细胞内的复制。

【目的】观察猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对猪肾传代细胞(PK-15细胞)炎性细胞因子白细胞介素(IL)mRNA转录水平的影响,探讨宿主与病毒之间的作用关系及细胞炎性反应机制。【方法】以未感染PCV-2的PK-15细胞为对照组,运用相对定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后,PCV-2DNA相对含量的变化,以及炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-17、IL-18mRNA转录水平在1,6,12,24,48,和72h的变化。【结果】PCV-2感染后,PK-15细胞的IL-6、IL-13、IL-17、IL-18的mRNA转录水平在...

【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子IFN-βI、FN-γI、FNAR-1I、FNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、RNaseL和IRF-3 mRNA转录水平的变化。【结果】PCV-2感染PK-15后1 h就可以检测到病毒DNA,在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖,于感染72 h时达到最高峰。与0 h相比,PCV-2感染后IFN-βI、RF-3的...

【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PG...

【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的猪肾细胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组,在测定了病毒半数感染细胞量(TCID50),复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后,制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中...

[目的]研究猪伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾传代细胞系(PK-15)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬在PRV感染复制过程中的作用。[方法]采用Western blot、透射电子显微镜(TEM)、激光共聚焦、siRNA转染等方法研究了PK-15细胞感染PRV后的细胞自噬。利用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分析自噬对病毒复制的影响,再通过沉默自噬相关基因Beclin-1,进一步观察自噬对PRV复制的影响。[结果]PRV感染PK-15细胞后,LC3-Ⅰ显著转化为LC3-Ⅱ,PK-15细胞内自噬小体的数量明显增加。PRV感染增加了LC3阳性斑点的细胞数。同时,变异毒株PRV ZJ01与传统毒株PRV LA诱导的自噬存在差异。自噬的药理学变化试验和siRNA转染结果还显示自噬能够促进PRV的复制。[结论]PRV感染PK-15细胞可以诱导自噬并有利于病毒的复制。

【目的】研究猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ２，ｐｃｖ２）感染ｐＫ－１５细胞后调控β－干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－β，ｉｆｎ－β）生成的信号通路，为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将ｐＫ－１５细胞随机分成５组：对照组、ｐｃｖ２组、ＢＸ７９５（ｔＢＫ１／ｉＫＫε抑制剂）组、ＢＡｙ １１－７０８２（ｎｆ－κＢ抑制剂）组和ＢＸ７９５＋ＢＡｙ１１－７０８２（混合抑制剂）组。ＢＸ７９５组、ＢＡｙ １１－７０８２组、ＢＸ７９５＋ＢＡｙ １１－７０８２组分别用０．５μｍｏｌ ＢＸ７９５、５μｍｏｌ ＢＡｙ１１－７０８２、０．５μｍｏｌ ＢＸ７９５＋５μｍｏｌ．．．

为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1 L反应器放大至3 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3 d细胞密度可达34.3×105cells/m L。采用感染复数为0

为了研究类猪圆环病毒2型因子P1和P2体外诱导的细胞凋亡作用,将P1和P2分子克隆分别转染PK-15细胞。结果表明,用透射电镜可以观察到P1和P2诱导PK-15细胞出现凋亡的典型形态学变化。

为探究连翘酯苷A（FA）对玉米赤霉烯酮（ZEA）诱导的猪肾上皮细胞（PK-15）凋亡的影响及其可能的保护机制，体外培养PK-15细胞，经36.55 μg·mL~(-1 )ZEA和不同浓度（31.25、62.5、125 μg·mL~(-1)）FA处理24 h，通过噻唑蓝（MTT）法测定细胞存活率；通过Hoechest 33342活细胞染色在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况；利用试剂盒检测细胞上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性和活性氧（ROS）水平；利用实时荧光定量PCR测定细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表达水平。结果表明：浓度在125 μg·mL~(-1)以下的FA可以提高PK-15细胞存活率；FA能显著提高经ZEA处理的PK-15细胞存活率，且能显著降低经ZEA处理的细胞上清液中的LDH活性，抑制ZEA引起的ROS的生成；ZEA能显著升高Bax、Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达量，Bcl-2 mRNA的表达量显著降低；不同浓度的FA能不同程度地提高Bcl-2 mRNA的表达量，降低Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的表达量。上述结果说明ZEA会诱导PK-15细胞发生凋亡，但FA可通过抑制内源性凋亡途径和氧化应激反应抑制细胞凋亡，从而起到保护作用。

［目的］探讨ｍｉＲ３９６在落叶松体细胞胚胎发生中的功能。以期该研究能为解决体胚发育中子叶畸形胚与生根率低的问题提供新的视角，同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络做基础铺垫。［方法］构建ｐＲｅ－ｍｉＲ３９６超表达载体，通过农杆菌介导侵染，将ｐＲｅ－ｍｉＲ３９６转入落叶松胚性细胞中，筛选稳定抗性细胞系。在ＤＮＡ与ＲＮＡ水平上，对抗性细胞系进行的鉴定、检测，同时统计比对其与野生细胞系间发芽率、叶片数目以及生根率的差异。［结果］在抗性细胞系基因组中，扩增出ＨＴｐ与ｍｉＲ３９６的特异性片段，且无农杆菌ＶｉＲｇ基因片段。ＲＮＡ表达水平上，抗性系ｐＲｅ－ｍｉＲ３９６与ｍｉＲ３９６表达皆增加，而靶基因ＬＡ．．．

【目的】探究lincRNA Cox2对BCG(Bacillus Calmette-Guérin)感染的RAW264.7巨噬细胞糖酵解进程的调控作用，阐明Mtb与巨噬细胞之间的相互作用，为结核病的诊断和治疗提供新的靶点。【方法】利用小干扰RNA敲减lincRNA Cox2的表达，以及使用miR-129-5p mimics过表达载体，结合BCG感染，通过实时荧光定量PCR检测lincRNA Cox2、miR-129-5p和促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达量；乳酸含量检测试剂盒检测乳酸（LD）的分泌情况；平板涂布法检测巨噬细胞菌载量情况；双荧光素酶报告基因系统验证lincRNA Cox2与miR-129-5p以及miR-129-5p与AMPK的互作关系；蛋白免疫印迹检测AMPK(AMP依赖蛋白激酶)及糖酵解途径中关键基因HK1（己糖激酶1）、PKM2（丙酮酸激酶2）和LDHA（乳酸脱氢酶）的表达变化。【结果】BCG感染12 h能够极显著上调RAW264.7巨噬细胞中lincRNA Cox2的表达（P=0.000013），与BCG组相比，siRNA+BCG组中AMPK(P=0.000771)、HK1(P=0.00323)、PKM2(P=0.000135)和LDHA(P=0.002532)的表达量以及乳酸的分泌量（P=0.020802）发生显著上调，而促炎因子IL-1β(P=0.000451)、TNF-α(P=0.000147)、IL-6(P=0.0001)的表达发生显著下调，菌载量试验表明siRNA+BCG组中的巨噬细胞菌载量显著下调（P=0.000127）。双荧光素酶报告基因系统表明lincRNA Cox2和miR-129-5p存在相互作用关系并以AMPK为靶基因。BCG感染RAW264.7巨噬细胞12 h后极显著下调miR-129-5p的表达（P=0.000156），与BCG组相比，miR-129-5p mimics+BCG组中AMPK(P=0.000262)、HK1(P=0.019524)、PKM2(P=0.001658)和LDHA(P=0.000887)表达量以及乳酸分泌量（P=0.044952）发生显著下调。【结论】lincRNA Cox2通过海绵吸附miR-129-5p并靶向AMPK，促进BCG感染的RAW264.7巨噬细胞糖酵解进程。

旨在探讨类猪圆环病毒P1感染对PK15细胞自噬的影响。将同一批PK15细胞分成对照组和感染组,感染组在类猪圆环病毒P1感染PK15细胞后14,24,48 h分别收集细胞,对照组也在同样时间收获,用透射电镜观察自噬现象的发生。结果表明,与对照组相比,感染组PK15细胞内出现典型自噬形态学变化。揭示类猪圆环病毒P1能诱导PK15细胞发生自噬,但细胞发生自噬的相关信号传导通路还有待进一步研究。

为探究gga-miR-17-5p在鸡脂肪沉积和肌肉发育中的作用，本研究以矮小品系S3(DW)和隐性白羽鸡（RR）为试验素材，分析gga-miR-17-5p在不同时期腿肌、肝脏、腹脂组织及细胞中的表达差异，并通过KEGG及蛋白互作分析筛选关键靶基因。结果表明：1)gga-miR-17-5p在腹脂、肝脏和腿肌组织中均可表达。在腹脂中，ggamiR-17-5p在0周表达有品种差异（P<0.05），且2个品种在0周时显著高于其他周龄（P<0.05）；在肝脏中，ggamiR-17-5p在16周有品种差异（P<0.05）,S3系在16周显著高于其他周龄（P<0.05），隐性白羽肉鸡在16周显著高于0周和8周（P<0.05）；在腿肌中，gga-miR-17-5p在0周有品种差异（P<0.05）,S3系在0周和2周显著于其它周龄（P<0.05），隐性白羽肉鸡在0周显著高于其他周龄（P<0.05）。2）在脂肪细胞中，gga-miR-17-5p在肌内脂肪细胞诱导分化6 d后的表达显著高于增殖期和分化1 d(P<0.05)；腹脂细胞分化1 d的表达最低，显著低于增殖期、分化4 d和分化6 d(P<0.05)。3）在成肌细胞中，gga-miR-17-5p的表达量随分化时间的延长而升高，且分化6 d的表达显著高于增殖期（P<0.05）。4)KEGG及蛋白互作分析表明，PTEN、MAPK3、PIK3R1、BECN1和PLCB4是gga-miR-17-5p重要的靶基因。RT-qPCR结果表明，PTEN和PIK3R1在成肌细胞增殖期的表达显著高于分化期（P<0.05）。综上，gga-miR-17-5p的表达存在显著的品种和组织差异性，miR-17-5p很可能通过PTEN、MAPK3、PIK3R1、BECN1和PLCB4来影响肌肉发育和脂肪沉积，其中PTEN和PIK3R1尤为关键。本研究为深入研究gga-miR-17-5p的功能和机制提供了坚实的理论基础和数据支撑。

【目的】研究IBV感染鸡气管黏膜上皮细胞(Chicken trachea epithelium cells,CTECs)中基底细胞的特性,以进一步揭示IBV感染与α-2,3-唾液酸受体之间的关系。【方法】利用光学显微镜观察、电子显微镜技术、RTPCR方法,对接种IBV的细胞进行观察和检测,研究IBV对基底细胞的感染特征。【结果】与CTECs感染IBV结果相反,单独培养的基底细胞接种IBV后,无明显的形态学损伤和亚细胞结构(溶酶体、细胞核)的损伤,细胞中也检测不到IBV的增殖。【结论】气管黏膜上皮细胞可以被IBV感染,单独的基底细胞不能被IBV感染,提示α-2,3-唾液酸受体是否存在与IBV感染...