本研究应用聚合酶链反应(PCR)建立了一种检测人及牛粪便中隐孢子虫卵囊 DNA 的方法.以蔗糖梯度离心法纯化鼠源 C.muris 卵囊;甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化牛源 C.muris、牛源 C.parvum 和鼠源C.parvum 卵囊.结果发现甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化隐孢子虫卵囊具有纯度高、回收率达96%、介质便宜及操作简便等优点.纯化卵囊经液氮冻融后按常规法提取 DNA 作为 PCR 模板.根据 GenBank 中C.muris 和 C.parvum 18SrRNA 基因序列,应用计算机辅助设计合成一对 PCR 引物(上游引物:5′-AAACCCAACTTTGCG...

为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。

【目的】建立快速、准确检测鸭副粘病毒病的方法。【方法】根据GenBank中发表的新城疫F基因序列设计1对引物,扩增鸭副粘病毒融合蛋白基因727bp的特异性片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了鸭副粘病毒病的RT-PCR诊断方法。应用建立的诊断方法,对从山东不同地区分离的20株疑似鸭副粘病毒毒株和150份疑似感染副粘病毒鸭的病变组织进行了检测。【结果】特异性试验表明,建立的RT-PCR检测方法能够从鸭副粘病毒SDFCH株中扩增到727bp的特异性片段,而对鸭瘟病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明,该法最低检出量的cDNA质量浓度为3pg/μL;山东不同地区...

【目的】建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段,与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到2.85×10-2fg的阳性参照DNA;对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,有较好的临...

从RAPD扩增的鳜鱼病毒 (SCV)核酸电泳带中回收了二个片断 ,克隆子pUC19质粒 (称为SCVE36 9和SCVE45 0 )。序列分析表明插入片段分别为 36 9bp和 45 0bp与GenBank序列没有显著的同源。根据克隆序列设计两对引物P1/ P2 和P3 /P4 ,在健康鳜鱼、病鳜以及提纯的SCV核酸中进行PCR试验。结果表明 ,P1/P2 组引物在SCV基因组中扩增出特异性核酸片段 ,可作为鳜鱼病毒PCR诊断 ,检测片段为 36 9bp。

【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫（Ｐａｒａｎｏｓｅｍａ ｌｏｃｕｓｔａｅ）的套式Ｐｃｒ方法，为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位ｒｎａ为目的基因，采用Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ软件设计两对特异的套式Ｐｃｒ引物Ｐ．ｌ．－Ｆ１／Ｐ．ｌ．－ｒ１和Ｐ．ｌ．－Ｆ２／Ｐ．ｌ．－ｒ２，将微孢子虫液用０．２ ｍｏｌ·ｌ～（－１） ｋｏＨ处理后得到的发芽液作为模板进行Ｐｃｒ扩增，建立以Ｐ．ｌ．－Ｆ１／Ｐ．ｌ．－ｒ１为外侧引物、Ｐ．ｌ．－Ｆ２／Ｐ．ｌ．－ｒ２为内侧引物的套式Ｐｃｒ，扩增产为分别为２９８和２４２ ＢＰ。对引物浓度、退火温．．．

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)有多个基因型,其中基因型d的感染率仅次于基因型b,建立PCV-2d基因型的PCR-RFLP诊断方法具有重要意义.根据NCBI中PCV2 Cap基因序列,设计1对特异性引物,并选择PCV-2d特异的酶切位点MSPI进行酶切,对酶切的体系和条件进行优化,同时进行敏感性、重复性试验.结果表明:PCR总体积25μL,模板量2μL,退火58℃,35个循环为PCR反应最佳条件,目的片段702 bp;MSPI酶能将PCV2d特异地切出2个条带474、228 bp.酶切体系为12.5μL、MSPI酶1μL、酶切时间1 h;该酶切体系的最低模板量为10 ng·μL-1,重复性好.送检的24份病料的PCV2d阳性率为33.3%.可见,本研究建立的PCV-2d基因型的PCR-RFLP鉴别诊断方法,特异、敏感.

根据NCBI公布的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测温和气单胞菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的131 bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为1.0 pg/20μL,对温和气单胞菌的检测灵敏度为50 cfu/20μL。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了温和气单胞菌常规PCR检测体系,该体系可以用于温和气单胞菌的诊断和样品的检测。

【目的】对新城疫(ND)国标RT-PCR诊断方法进行改进和优化,建立一种灵敏度高、特异性好、能直接从组织病料中进行目的基因检测的NDV套式RT-PCR(nest RT-PCR,RT-nPCR)方法。【方法】根据GenBank上发表的新城疫病毒基因序列,设计并合成了2对引物,通过筛选最佳RT-nPCR条件,建立了NDV RT-nPCR检测方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等,验证了RT-nPCR方法的可靠性和适用性。【结果】建立的NDV RT-nPCR方法灵敏度较高,检测的极限为5.6×10-5 ng/L;特异性较好,仅能从NDV中扩增到目的条带。从6份疑似组织病料中能直接检测出...

犬病专家诊断系统的建立与应用吴德华徐汉坤顾劲乔（公安部南京警犬研究所，南京２１００１２ＥｘｐｅｒｔｓｙｓｔｅｍｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｄｏｇｄｉｓｅａｓｅｓＷｕＤｅｈｕａ，ＸｕＨａｎｋｕｎａ...

运用卫生经济学方法,对胶体染料试纸条法(DDIA)、环卵沉淀试验(COPT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等3种免疫诊断方法在血吸虫病低度流行区现场应用的成本—效益进行分析,证实了胶体染料试纸条法更经济实用。

【目的】利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95....

　依据国内外近年来的研究结果,总结了用于全蚀病菌鉴定和诊断的几种主要分子生物学技术,并对分子生物学技术诊断中的实用性及其发展方向进行了评价。

【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25μL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃10 s,39℃20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10拷贝/μL,对已知阳性临床组织样品可检至1:103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。

【目的】探讨细粒棘球蚴CE18重组蛋白作为绦虫蚴病免疫诊断抗原的应用价值,为筛选绦虫蚴病血清学诊断抗原提供依据。【方法】应用棘球蚴CE18重组抗原建立间接ELISA方法,分别对18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、19份棘球蚴感染绵羊血清及194份棘球蚴病疫区绵羊血清和13份健康羊血清进行检测,通过显著性差异分析评价CE18蛋白作为诊断抗原的意义。同时,应用生物学软件对CE18抗原蛋白同源序列进行分析,进一步从分子水平上提示CE18蛋白作为绦虫蚴病诊断抗原的依据。【结果】序列分析表明棘球蚴CE18蛋白基因为多种绦虫如泡状带绦虫、多头带绦虫、猪带绦虫等的共有序列,其蛋白质氨基酸序列相似性很高,不同种...