为了探讨牛布鲁氏菌544A株感染巨噬细胞的c DNA文库中筛选与Omp22相互作用的蛋白,对布鲁氏菌的致病机理进行研究。将布鲁氏菌细胞膜可分为3组:第1组为94 k Da的外膜蛋白,第2组为41~43 k Da外膜蛋白,第3组为22~31 k Da的外膜蛋白。第1组外膜蛋白只是外膜蛋白的一小部分;第2组外膜蛋白是布鲁氏菌细胞外膜孔道蛋白;第3组外膜蛋白是由两种相关的22 k Da蛋白和31 k Da蛋白组成,31 k Da蛋白已经被证实了是一类细胞外膜孔道蛋白,而22 k Da蛋白(Omp22)的功能还不是很清楚。酵母双杂交技术是一种常用的而且有效地研究蛋白-蛋白相互作用的方法,已经广泛的应用...

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp2...

为探讨牛种布鲁氏菌sigma因子RpoE2的功能,采用酵母双杂交技术对RpoE2蛋白与anti-sigma因子之间的互作进行研究;通过环境应激试验评价了rpoE2缺失株对强氧化环境、酸性pH、杀菌性阳离子多肽、铁缺乏环境的耐受能力;通过比较亲本菌株和缺失株在巨噬细胞感染模型和小鼠感染模型中的生存能力,研究了rpoE2基因是否与牛种布鲁氏菌毒力相关。结果显示:牛种布鲁氏菌的RpoE2蛋白可以与anti-sigma因子相互作用,牛种布鲁氏菌rpoE2基因缺失后,对各种应激环境的耐受能力均无影响,并且巨噬细胞和

为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株,本研究利用同源重组和负筛选技术,构建了流产布鲁氏菌株2 308的ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14,并通过菌落染色和凝集特性,培养传代,小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究。结果表明:1)缺失菌株BDA14为粗糙型菌株,体外培养传代表型不发生改变;2)缺失菌株BDA14在小鼠体内的毒力与亲本菌株2308相比显著降低,且不产生针对OPS(O-antigen)的抗体;3)缺失菌株BDA14可提供与疫苗株RB51相当的攻毒保护力;4)缺失菌株BDA14对怀孕靶动物的安全性显著提高,接种怀孕羊不引起流产。说明ATP/GT...

探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P

巨噬细胞炎症蛋白-3α是一种可诱导的分泌蛋白,通过相应受体对多种免疫细胞产生趋化,在多种疾病的免疫反应和炎症损伤中发挥重要作用。实验采用RT-PCR技术克隆出黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaCCL20)的成熟肽基因序列,通过双酶切将目的基因序列插入到表达载体pET-32a上,然后转化进大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白,以该融合蛋白为抗原制备多克隆抗体并进行Western-blotting鉴定及抑菌性检测。实验表明,融合蛋白在37℃、0.8 mmol/L IPTG,4 h条件下得到高效表达;经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blott...

布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病,也是引起动物繁殖障碍的主要疾病之一。近年来,我国人、畜间布鲁氏菌病呈高发态势,严重威胁畜牧业发展和人群身体健康。及时准确诊断对控制和净化布鲁氏菌病具有重要意义。本研究从病原学和血清学两方面对布鲁氏菌病的现有诊断技术进行概述,同时指出布鲁氏菌免疫原性蛋白抗原的筛选和研究,对布病的控制和净化意义重大。

为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。

［目的］鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）感染会引起鸡的免疫抑制，给养禽业带来巨大危害。本文旨在探讨鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）蛋白ＶＰ４和ＶＰ５在病毒感染引起的免疫抑制中的作用。［方法］构建ＶＰ４和ＶＰ５蛋白的真核表达质粒并转染Ｖｅｒｏ细胞，再用ＩＢＤＶ ＣＶ０３病毒株感染转染后的细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ方法检测细胞中模式识别受体及下游转录因子的表达；ｒｔ－ｑ ＰＣｒ检测细胞因子及抗病毒基因的表达。［结果］ＩＢＤＶ ＣＶ０３病毒感染Ｖｅｒｏ细胞后，ＶＰ４蛋白在一定程度上能够提高ｔｌｒ３、ｒＩＧ－Ⅰ蛋白含量，但差异不显著；ＶＰ５对ｔｌｒ３、ｒＩＧ－Ⅰ等介导的天然免疫通路有一定的抑制作用；过．．．

[目的]本试验旨在探究刚地弓形虫热休克蛋白21（TgHSP21）在体外对小鼠巨噬细胞系(Ana-1)功能的调节作用。[方法]构建重组表达载体pET-32a (+)/TgHSP21，获得重组蛋白TgHSP21（rTgHSP21）。用免疫荧光抗体试验（IFA）验证rTgHSP21在体外与Ana-1细胞的结合情况。Ana-1细胞分别用不同浓度的rTgHSP21处理后，采取细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖情况，应用Transwell细胞小室检测细胞趋化情况，应用流式细胞术检测Ana-1细胞凋亡和吞噬能力。Ana-1细胞NO(一氧化氮)和肿瘤坏死因子α (TNF-α) 、白介素12（IL-12）、白介素6（IL-6)、白介素1β (IL-1β) 的分泌量分别用总NO试剂盒和细胞因子酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒来检测。[结果]成功获得纯化的rTgHSP21，具有与Ana-1细胞结合的能力。rTgHSP21在浓度为5和10 μg·mL~(-1)时显著促进Ana-1细胞的增殖，各个浓度的rTgHSP21均显著促进细胞凋亡和吞噬能力。80 μg·mL~(-1)的 rTgHSP21明显促进Ana-1细胞NO的分泌。在不同浓度下，细胞因子IL-6和TNF-α的表达量均明显上升。而在浓度为10、20、40和80 μg·mL~(-1)时细胞因子IL-12的分泌被抑制。此外，rTgHSP21显著抑制了Ana-1细胞的迁移能力。[结论]TgHSP21能够与Ana-1细胞结合并在体外条件下影响Ana-1细胞的凋亡比例、趋化性、增殖和吞噬能力，对Ana-1细胞的细胞因子IL-6、TNF-α、IL-12和NO的分泌也有影响。

利用已构建的黄喉拟水龟(Ma)SMART全长cDNA文库,筛选得到巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)全长cDNA序列,通过设计引物、克隆测序验证,采用相关软件对基因的结构与功能进行预测,并利用实时荧光定量PCR对MaCCL20组织表达特征进行分析。序列结构分析结果表明,MaCCL20 cDNA全长2 318 bp,开放阅读框为261 bp,共编码86个氨基酸,其蛋白为疏水性,不存在跨膜结构。同源性分析表明,黄喉拟水龟CCL20与变色蜥(Anolis carolinensis)亲缘关系最近,与原鸡(Gallus gallus)其次,与哺乳动物的同源性很低;荧光定量PCR结果表明,MaCCL2...

[目的]旨在研究旋毛虫钙网蛋白（rTs-CRT）对宿主免疫系统的影响。[方法]用原核表达技术获得纯化旋毛虫钙网蛋白，并进行Western Blot验证；将rTs-CRT与小鼠巨噬细胞共孵育，检测该蛋白对小鼠巨噬细胞增殖、NO释放和凋亡的影响；将rTs-CRT与大鼠外周血单核细胞（PBMC）共孵育，检测该蛋白对大鼠PBMCs转录因子和细胞因子的影响。[结果]Western Blot结果显示rTs-CRT可以被感染旋毛虫的大鼠血清所识别；rTs-CRT可促进小鼠巨噬细胞的增殖和NO的分泌，抑制小鼠巨噬细胞的凋亡；rTs-CRT下调大鼠PBMCs T-bet、Gata-3和PU.1的转录水平，上调Foxp3、Ahr、RORγt和Bcl-6的转录水平；rTs-CRT上调大鼠PBMCs IFN-γ、IL-17、IL-10、TGF-β、Il-9和IL-22等细胞因子的转录水平，下调IL-4和IL-21的转录水平。[结论]旋毛虫钙网蛋白可刺激宿主产生Th1、Th17、Treg、Th9和Th22等多种类型的免疫反应，抑制Th2和Tfh免疫，对宿主免疫调节作用复杂。

鱼类诺卡氏菌病是一种慢性系统性肉芽肿疾病,鱼诺卡氏菌是其主要病原。鱼诺卡氏菌全基因组生物信息学分析,发现了一个可能靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白——动力蛋白调节蛋白robl/LC7。为了对鱼诺卡氏菌robl/LC7的亚细胞定位和功能进行初步研究,实验对鱼诺卡氏菌robl/LC7进行了基因克隆、真核表达重组质粒构建、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和凋亡检测。结果显示,成功克隆了鱼诺卡氏菌robl/LC7基因并构建了其真核表达质粒p EGFP-robl/LC7和pc DNA-robl/LC7;

【目的】本文研究Ⅹ蛋白（Protein Ⅹ，pⅩ）在血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus Serotype 4，FAdV-4）感染LMH细胞后对Toll样受体产生的影响，为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。【方法】通过PCR扩增X基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α- HA-X。将重组表达质粒pEF1α-HA-X和空质粒pEF1α-HA分别转染LMH细胞，24 h后用FAdV-4感染转染后的细胞，2个处理组分别标记为pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+；同时设立转染后未加病毒刺激组作对照，分别标记为pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。用Western-blotting和间接免疫荧光验证重组蛋白表达情况，实时荧光定量PCR检测Toll样受体（chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21）和效应因子（IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15）mRNA转录水平的变化。【结果】X基因开放阅读框（ORF）全长540 bp，共编码179个氨基酸残基。Western-blotting结果显示重组X蛋白与HA标签小鼠源单克隆抗体反应，在27 kD处得到单一条带，间接免疫荧光结果可见绿色荧光。实时荧光定量PCR检测发现，与pEF1α-HA-组相比较，pEF1α-HA-X-组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著上调（P<0.01，下同），分别为pEF1α-HA-组的9.76和12.34倍；chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA转录水平显著上调（P<0.05，下同)。添加病毒感染后，与pEF1α-HA-X-组相比，pEF1α-HA-X+组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著下调，分别下调60%和66.7%；chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA转录水平显著提高，分别上调2.91、2.01和1.47倍（P<0.05），其他chTLRs的mRNA转录水平下调，但差异不显著（P>0.05）；同时，pEF1α-HA-X+组效应因子IFN-α、IFN-β、IL-1β的mRNA转录水平比pEF1α-HA-X-组显著上调，IL-8的mRNA转录水平极显著下调。【结论】在LMH细胞过表达pX并被FAdV-4感染后，pX能激活宿主免疫应答系统，Toll样受体（chTLR2a、chTLR2b和chTLR3）和其效应因子（IFN-α、IFN-β和IL-1β）的mRNA转录水平显著上调以抑制病毒复制，说明pX具备激活宿主细胞天然免疫系统的功能。

弓形虫病的免疫是以细胞介导为主的免疫,其中,Mφ是机体抗弓形虫感染重要的效应细胞.本文旨在明确 TF 在体外激活小鼠腹腔 Mφ后的形态变化及对弓形虫消化的影响进行初步观察.按常规方法制备健康昆明鼠腹腔 Mφ,加含犊牛血清的1640培养液37℃培养,2 h 后洗去非沾附细胞,胰酶消化,洗涤、计数 Mφ,按6×10~5/mL 分装含飞片的培养瓶(1 ml/瓶~(-1)),另制备弓形虫免疫的猪脾脏细胞 TF_1和未免疫健康猪脾 TF_2加入含 Mφ培养瓶.另设不含 TF 的 Mφ对照瓶(组)。37℃密闭培养60 min