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[期刊] 华北农学报
[作者]
杨苏珍 张改平 鲍登克 乔松林 万博 樊剑鸣 职爱民 李学伍
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 方玉珍 潘丽 蒋守田 吕建亮 刘力宽 张中旺 张淑刚 李正丰 杜进鑫
以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李润成 余兴龙 白霞 侯强红 罗维 刘忠华 向卫军
通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张娅 曾君祉 陈耀锋 黄华
为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘新生 王永录
以AF/72RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRI酶切法鉴定。应用BIMAS生物学软件对AF/72株结构蛋白VP1的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld、A20限制性T细胞表位进行预测,并对不同限制性的T细胞表位进行对比。结果表明,口蹄疫AF/72株结构蛋白VP1长639bp,编码213个氨基酸。不同限制性的T细胞表位虽然不尽相同,但与已鉴定的T细胞表位相比较,它们之间也有一些类似的、并且可能是通用型的T细胞表位。本试验通过生物信息学方法预测AF/72结构蛋白VP1的T细胞表位,为进一步试验确定...
关键词：
口蹄疫病毒 T细胞表位 VP1蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
薛霜 独军政 高闪电 常惠芸
利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊...
[期刊] 华北农学报
[作者]
常惠芸 丛国正 独军政 邵军军 林彤 冯金瑞 刘萍
将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达,Western Blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
代文君 王洪梅 刘晓 高运东 于力 王立群 仲跻峰 何洪彬
【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。
关键词：
口蹄疫病毒 VP1 转染 稳定细胞系
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王文秀 顾节清 陈德坤 邓文 潘丽 王宝琴 王永录 张永光
将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕研丽 沈小燕 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏
为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。从重组质粒pMD18-T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经BamHⅠ/HindⅢ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞,免疫组化检测转染细胞中3D基因表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达。...
[期刊] 华北农学报
[作者]
田飞鹏 曹轶梅 卢曾军 孙普 高云英 刘在新
构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表...
关键词：
口蹄疫病毒 衣壳蛋白 重组杆状病毒 构建
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
寇铮 陈绳亮 钟靖 李天宪 喻子牛
采用湖北省云梦县患鹦鹉幼雏病死亡的虎皮鹦鹉体内分离得到的鹦鹉幼雏病毒 (budgerigarfledglingdiseasevirus,BFDV) ,应用PCR方法获得BFDV主要结构蛋白基因 (VP1) ,克隆到 pMD18 T载体 ,构建重组质粒 pMD18T VP1并进行测序 ,结果显示 ,结构蛋白基因 (VP1)与BFDV欧美分离株的同源性为 96 %～ 99% ,表明VP1是BFDV保守基因 ;将VP1亚克隆到原核表达载体pET32 (+)b ,构建重组质粒 pET32 (+)b VP1,转化菌株BL2 1(DE3) ,诱导表达 ,经SDS PAGE和Western blot分析 ,...
[期刊] 华北农学报
[作者]
周建华 丛国正 高闪电 常惠芸
以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-TEasy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定。该毒株与Poliovirus,Hepatitis Avirus和Human rhi-novirus 89毒株3C序列对比分析发现核苷酸序列一致性分别为38.8%,37.1%和36.5%,氨基酸序列一致性分别为23.7%,19.2%和17.6%。通过Swiss-pdbViewer软件模拟出FMDVOA/58 3C蛋白酶的3D结构和表面模型。并鉴定出此毒株3C蛋白酶的活性中心为Cys31-His46-Asp84。
关键词：
口蹄疫病毒 3C蛋白酶 活性位点
[期刊] 华北农学报
[作者]
周建华 丛国正 高闪电 常惠芸
以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。该毒株与A12,O1K,O1Campos和TW45/97毒株序列通过对比分析发现,L基因中有2个起始密码子,第二个是首选;并且确定氨基酸保守区主要位于第35～39,43～54,65～67,75～80,90～111,113～142,144～146,148～157,159～172和176～187位。L蛋白酶含有球状区域,碳端有一柔性杆状结构。合成的L蛋白酶可形成二聚体结构。第144位的Lys、148位的His和163位...
关键词：
口蹄疫病毒 L蛋白酶 活性位点
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