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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
叶志滨 王晓明 吕茜 刘雨桐 金季赜晓 朱馨艺 黄金虎 王丽平
[目的] 产新德里金属β-内酰胺酶-5（NDM-5）的革兰阴性耐药菌对人畜健康产生巨大威胁。本文旨在初步探究大蒜辣素对NDM-5的抑制作用及其相关作用位点，为临床开发新型β-内酰胺酶抑制剂提供理论支持。[方法] 通过AutoDock模拟分子对接，预测大蒜辣素与NDM-5的结合位点；构建突变型载体pET21a-NDM-5-C208A，测序验证无误后转入感受态大肠埃希菌BL21（DE3），通过药敏实验进行突变表型确认；采用微量肉汤棋盘法和时间杀菌曲线测定评价大蒜辣素与美罗培南对NDM-5突变型细菌的联合抑菌效果。最后，通过体外表达突变蛋白NDM-5-C208A，建立酶活性测定体系比较大蒜辣素对C208突变型NDM-5和野生型NDM-5酶活性的抑制效果。[结果] 经测序证实NDM-5的C208A突变株BL21(DE3) pET21a-NDM-5-C208A构建成功，C208A突变株恢复了对头孢类和碳青霉烯类抗生素的敏感性，且大蒜辣素与美罗培南联用的FICI由0.375增加至2，联用表现为独立作用而非协同作用；体外酶活测定结果显示NDM-5-C208A突变不仅使酶活性下降约85%，而且该位点突变导致大蒜辣素对NDM-5失去抑制作用。[结论] Cys208位点是维持NDM-5水解酶活性的关键位点，且大蒜辣素可通过与该位点结合发挥抑制酶活性的作用。该结果为大蒜辣素作为新型β-内酰胺酶抑制剂的开发和应用提供数据和参考。
关键词：
大蒜辣素 NDM-5 美罗培南 酶抑制剂
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
严梦涵 许丽惠 游泽龙 陆芍华 何晴 郑娱 许高琳 王全溪
利用生物信息学软件I-Mutant2.0分析植物乳酸菌素PlnJ的氨基酸序列，筛选出最不稳定的氨基酸位点，进行定点突变，构建点突变重组表达质粒。对点突变重组表达质粒进行原核表达，并筛选表达最适条件；采用镍亲和层析法纯化重组蛋白。以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌，探究100℃水浴加热0、5、15、30 min对重组PlnJ抑菌功能的影响。结果表明，PlnJ第3位氨基酸——赖氨酸(AAG)对其稳定性具有重大影响。以人工合成第5位氨基酸，即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)的PlnJ核苷酸序列作为模板，成功构建重组表达质粒，PCR和酶切鉴定结果显示目的条带184 bp,测序后证明突变成功。重组蛋白诱导表达条件的优化结果表明：在37℃、12 h、0.8 mmol·L~(-1)IPTG的最优诱导条件下，特异目的蛋白表达显著(27.5 ku);咪唑洗脱液浓度280 mmol·L~(-1)是最优洗脱条件，可获得较为单一的目的蛋白。采用牛津杯抑菌试验法及麦氏比浊法比较突变前后的PlnJ蛋白的抑菌效果，结果表明，突变后的蛋白[PlnJ(G5)]与突变前的蛋白(PlnJ)100℃加热0、5、15、30 min,对大肠杆菌的抑菌效果均差异显著(P<0.05),而对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均差异极显著(P0.05)。综上，第5位氨基酸，即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)后，PlnJ(G5)的热稳定性得到了提高，且不改变其抑菌效果。
[期刊] 财务与会计
[作者]
信用5C分析法就是通过"5C"系统来分析顾客或客户的信用标准,具体包括五个方面:1、品质(Character):指顾客或客户努力履行其偿债义务的可能性,是评估顾客信用品质的首要指标,是应收账款的回收速度和回收数额的决定因素。因为每一笔信用交易都隐含了客户对公司的付款承诺,如果客户没有付款的诚意,则该应收账款的风险势必加大。2、能力(Capacity):指顾客或客户的偿债能力,即其流动资产的数量和质量以及与流动负债的比例,其判断依据
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
令狐远凤 杨阳 潘永 段世宇 张家莉 张宝太 杨琦
通过5′RACE技术分析fadL、ompN、ybfM mRNA的5′UTR,并筛查fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序(ARN)n.利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基础上的lacZ基因融合菌株，运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株，通过β-半乳糖苷酶试验检测重组菌株的蛋白水平.结果显示，fadL中筛选出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT),其缺失降低了fadL的蛋白表达量，分别降低72%、56%;ompN中筛选出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-4(TTTGCT),其缺失提高了ompN的蛋白表达量，分别提高了1.29、1.30、1.07倍，ARN-3(ATTATT)缺失使ompN的蛋白表达量降低了10%;ybfM中筛选出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG),其缺失均增加了ybfM蛋白水平变化，分别为4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.结果表明，ybfM、ompN、fadL中(ARN)n位点不同缺失能导致ybfM、ompN、fadL表达水平出现上调或下调，部分(ARN)n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
沈玲 郭正彦 吴文君
【目的】为新型抗生素的开发研究提供有效途径。【方法】对放线菌SL-5在链霉素不同浓度下的耐药突变菌株进行分离和活性筛选,并采用单因素和正交试验对活性菌株进行发酵优化。【结果】从无活性放线菌SL-5的耐药菌株中得到1株活性突变菌株str-14,室内生测结果表明,其发酵液对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的抑菌圈直径为17.5 mm。通过单因素和正交试验,确定该菌株的最佳摇瓶发酵培养基配方为:小米10 g/L,葡萄糖20g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨7 g/L,混合VB1.5 mg/L,NaCl 2.5 g/L,CaCO32.0 g/L。最佳培养条件为:初始pH为8.0,装液量70...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
郑宗林 汪开毓 肖孟玮 王均 李岚敏 贺扬 陈德芳 黄凌远
采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70ku和27ku,浓度达到6.4mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾后第3周抗体水平开始增加,第4周...
[期刊] 企业管理
[作者]
小寒
在工作中遇到困难时，人们总会想尽办法拖延。这时，我们应该掌控好执行力、行动力、心力，提升自我效能，战胜困难。这里有5点建议：处理事情之前先处理心情。人的心情常常受很多因素的影响，内心处于纠结、压力状态时就没有足够的精力处理工作中的棘手问题。任何人都要学会了解自己，调节心态，处理好自己与外部的关系。提升心力。要保持良好的睡眠及饮食习惯，平衡工作与生活，找到适合自己的工作节奏，保持舒适的身心状态。
关键词：
“动”起来
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
周向珍 朱辉
以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有Tn5-sacB插入,三亲本转化效率为3.75×10(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李庆勇 可小丽 卢迈新 朱华平 高风英
为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBIProten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑雪芳 刘波 朱育菁 陈德局 陈小强
【目的】研究青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标"弱化指数(attenuation index,AI)"和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数(chromatography titer index,CTIi),CTIi=Si/(S1+S2+S3)×100
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
凌雯 龚晓明 杨震 杜念兴
应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对畜型和禽型两个融合基因ＨＢｓＡｇ／ＬＨＲＨ的５′端分别作了改造，切去了融合基因起始密码ＡＴＧ前一段非编码序列６１个碱基，将改造后的融合基因插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｅ１１ＫＳ＋质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ强启动子的表达载体ｐＥＴ１５ｂ中，经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＥ３中表达，表达量占菌体总蛋白的１０％，以兔抗ＬＨＲＨ抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，出现阳性反应带。用抗ＨＢｓＡｇ抗体作ＥＬＩＳＡ检测，结果稀释１×１０－６时仍为阳性反应。
[期刊] 企业管理
[作者]
陶五强
在日本大行其道,并给企业带来丰厚回报的5S,飘洋过海来到中国,却常常变了一副面孔。我们长久以来形成的一些不良的文化,在推进5S进程中表现得淋漓尽致。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
谭秀明 陈雪风 林敏怡 刘琼光
采用转座子Tn5插入突变技术,共获得5 261个接合子。通过马铃薯软腐快速筛选和PCR检测验证,获得267个使马铃薯软腐能力丧失或下降的Tn5插入突变体,并测定其在水稻上的致病力和烟草上的过敏性坏死反应(HR)。结果表明:在267个突变体菌株中,对水稻无致病力的有71个,其中在烟草上无HR反应的有59个,产生HR反应的有12个;对水稻致病力下降的有68个,其余突变体菌株对水稻致病力与野生菌株差异不明显。另外,267个突变体菌株中有146个无HR反应,其中有90个对水稻无致病力或者致病力下降。致病力的分析结果表明,获得的突变体是由Tn5插入Dickeya zeae染色体上不同的致病相关基因位点导...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孟平红 赵宁 马玉华 陈之林 邓英 郭惊涛 张兴国
【目的】对拟南芥肌醇磷酸合酶AtIPS1进行亚细胞水平定位,并验证AtIPS1与细胞程序化死亡(PCD)相关蛋白ATXR5或ATXR6的相互作用。【方法】构建pAtIPS1::AtIPS1-GFP融合基因表达载体,并分别转化烟草BY-2细胞和拟南芥植株,共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的分布。采用双分子荧光互补(BiFC)技术分析AtIPS1与ATXR5/6的相互作用,并观察突变体atips1的表型。【结果】AtIPS1定位于细胞质和细胞核。AtIPS1与ATXR5和ATXR6之间存在相互作用,且互作位点与AtIPS1的细胞定位一致。突变体atips1叶片上自然产生细胞死亡的表型,外源增加...
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