为在蛋白水平上探索紫花苜蓿MsWRKY33在抗逆性上的生物学功能,以紫花苜蓿品种中苜1号为材料,克隆了MsWRKY33抗原序列并对其性质和功能进行初步分析。对MsWRKY33蛋白的结构和特性进行生物信息学分析表明,MsWRKY33蛋白全长511 aa,主要由无规则卷曲和延伸链结构组成,不具有信号肽,是一个亲水性蛋白,免疫原性预测结果表明该蛋白免疫原性较强。结合序列的特异性选取适宜区段247～457 aa,利用该区段经蛋白纯化、免疫等步骤制备了MsWRKY33多克隆抗体。后续又采用Western Blotting的方法,对4种非生物胁迫(高盐、冷、PEG、ABA)下MsWRKY33蛋白的表达情况进行分析,发现4种胁迫均能诱导MsWRKY33蛋白表达增强,其中盐胁迫的诱导表达丰度最高,表明MsWRKY33在调控植物的高盐逆境响应中可能具有重要作用。试验结果为深入探索紫花苜蓿MsWRKY33基因功能及其对非生物逆境的抗性调控机制提供依据。

以脱落酸（ＡＢＡ）为配基，分别通过其Ｃ１位和Ｃ４′位偶联的亲和层析柱对玉米根尖中的膜ＡＢＡ结合蛋白（ＡＢＢＰ）进行了纯化，其中，用Ｃ１偶联的亲和柱具有较高的纯化效率；对比了以尿素和硫氰化钾（ＫＳＣＮ）为解吸附剂的洗脱效果，发现使用后者（３ｍｏｌ／Ｌ）能得到纯净的ＡＢＢＰ；放射性配基结合分析（ＲＬ－ＢＡ）结果表明，经过亲和纯化后的ＡＢＢＰ具有受体的基本特性——专一结合ＡＢＡ的能力。以Ｃ１－ＡＢＢＰ和Ｃ４′－ＡＢＢＰ为免疫原，制备了２种多克隆抗体。

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单...

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异

【背景】轮状病毒（Rotavirus,RV）是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一，在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）引起的一种急性肠道传染病，常造成仔猪消化道功能紊乱，引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状，一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前，针对PoRV感染尚无特效药物治疗，疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而，PoRV基因型多且易变异，不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此，亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究，探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体，为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后，克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后，采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔，每隔14 d加强免疫一次，经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达，以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白，SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带，并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体，ELISA效价均超过1﹕81 000，表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应，与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达，但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达，这一结果可能与NSP2的表达特性有关，有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白，并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。

采用重复漂洗 离心法分离纯化了杜仲橡胶颗粒 ,SDS_PAGE分析发现杜仲橡胶颗粒含有十几种蛋白 ,其中以 5 6ku、30ku 2种蛋白的丰度较高 ,分别称之为EuRPP56 和EuRPP30 。对杜仲雌雄株的比较表明 ,杜仲雌株叶片、雌株树皮及果皮中橡胶颗粒蛋白均是EuRPP30 含量高于EuRPP56 ,而雄株叶片、雄株树皮中正相反。进一步分离纯化了杜仲橡胶颗粒中丰度较高的 30ku蛋白 ,并制备了该蛋白的抗体。免疫细胞化学分析结果表明 ,在叶片的含胶细胞中有阳性反应 ,而其它细胞无阳性反应。以上工作为研究杜仲胶粒结合蛋白功能以及阐明杜仲胶生物合成机制奠定基础

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Western-blotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识...

Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku。利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体。Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并...

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...

针对加工副产物鲍鱼外套膜利用率低的现象，对鲍鱼腹足和外套膜胶原蛋白相关性质进行比较研究，以期为鲍鱼的综合加工提供一定的理论依据。本研究以皱纹盘鲍为原料分别提取得到腹足酶促溶性胶原蛋白（ｐｅｐｓｉｎ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｆ ａｂａｌｏｎｅ ａｄｄｕｃｔｏｒ，ｐｓｃ１）和外套膜酶促溶性胶原蛋白（ｐｅｐｓｉｎ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｆ ａｂａｌｏｎｅ ｍａｎｔｌｅ，ｐｓｃ２），对ｐｓｃ１和ｐｓｃ２相关特性进行比较分析，并利用ｐｓｃ１制备得到兔抗鲍鱼胶原蛋白多克隆抗体。ｓｄｓ－ｐａｇｅ显示，ｐｓｃ１和ｐｓｃ２分子组成均为（α１）３，且α１的分子量为１４０ ｋｕ，与水产无脊．．．

针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行,对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国,尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道,鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种,其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染,随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1 044 bp,开放读码框(ORF)为954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量为36.38 ku;5′非编码区(NCR)为19 bp,3′非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白,在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51 200,且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察,发现肝脏组织坏死并形成合胞体,脾脏部分细胞出现空泡、坏死,含铁血黄素增多,头肾细胞坏死,鳃丝上皮细胞明显解离脱落,鳃小片黏连,脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测,结果显示,NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达,以肝脏组织中表达量最高。为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达。研究表明,在感染早期(感染后12～24 h),病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达,可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制。本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础。

[目的]克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。[方法]提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brach yury基因CDS全长序列连接至pEASY~?-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY~?-Blunt E1-Brach yury,并进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB(DE3)大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA(iELISA)法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。[结果]克隆了1335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY~?-Blunt El-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。[结论]成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Wes...