【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-

【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5(BIRC5)进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示...

牙鲆(Paralichthysolivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400bp含有"种子序列"的Otx23′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明:pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致; TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32dph、36dph时期,pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡，同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗，文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响，为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上，获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p，利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况；通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况；构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体，在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照，采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系；在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达，使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响；同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织；RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达，miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期，而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期，表现出负调控的现象；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）;EdU试验分析显示，过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%，极显著高于阴性对照组的10.43%(P<0.01)。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件，BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一，miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡，该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。

【背景】MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子（18—23nt），广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现，miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍，但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量，为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本，采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)技术，构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法，研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库，预测miR-221的靶基因，结合功能富集分析，确定目标靶基因，构建靶基因的野生型和突变型载体，进而用双荧光素酶报告实验，验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明，miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达，其中在肺脏和脾脏中的表达量最高，在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明，miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现，miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05），表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现，过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05），沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量，最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。

为探讨miR-376b-5p靶向调控IGF1影响绵羊多羔性状的分子机制，本研究根据产羔记录选取高、低产羔数小尾寒羊各5只，同期发情处理后，采集卵泡期卵巢及其他6个组织，通过RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-376b-5p与IGF1在高、低产羔数小尾寒羊各组织中的表达量；并确定二者之间的靶向关系；随后，将体外合成的miR-376b-5p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至绵羊卵巢颗粒细胞中，检测miR-376b-5p对IGF1表达水平的调控情况，同时对多羔性状TGF-β信号通路中TGFβ1和PTGS2标志因子的表达进行分析。结果表明：1)组织表达谱显示，IGF1在绵羊卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.01);miR-376b-5p定量结果显示其表达趋势与IGF1相反(P<0.05),而抑制miR-376b-5p后则相反，表明miR-376b-5p可显著抑制IGF1的表达；4)在绵羊卵巢颗粒细胞中过表达miR-376b-5p后，TGF-β信号通路中TGFβ1、PTGS2的表达量均显著低于阴性对照组(P

为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。

【目的】肠炎是家兔最常见且死亡率最高的消化道代谢疾病,给家兔养殖业带来巨大的经济损失。圆小囊作为家兔特有的免疫器官,在家兔肠炎中起重要的调节作用。本试验通过研究家兔圆小囊中microRNAs(miRNAs)的表达差异,探究miRNAs与家兔肠炎发生和调节的分子机制。【方法】本试验以60只新西兰兔为试验样本,采用低纤维饲料(纤维素CF 9%、木质素ADF 13%)诱导家兔非特异性消化道紊乱型肠炎发生,通过临床症状和切片观察将试验样本分为4组(n=9),即健康对照组、诱导健康组、轻微组、严重组;检测家兔圆小囊中miR-130b以及相关炎症因子白介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-18(IL-18)的表达,通过miRBase、targetscan等预测miR-130b与STAT3的靶向关系,同时利用q PCR检测STAT3的表达量。【结果】圆小囊中,IL-22、TNF-α、IL-18表达量上调,严重组显著高于其他组(P<0.05),miR-130b表达随着炎症程度的加深表达显著下调,2个患病组极显著低于2个健康组(P<0.01);STAT3随着炎症程度加深表达量显著上调,2个患病组极显著高于2个健康组(P<0.01)。【结论】在家兔非特异性消化道紊乱型肠炎发生过程中,圆小囊中的miR-130b通过靶向STAT3参与炎症的发生并发挥作用。

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织(黑色和白色)进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤

为分析chi-miR-107-3p及相关基因在不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中的表达情况，本研究分别在毛囊休止期（4月）、兴盛前期（7月）、兴盛期（9月）和退行期（1月）采集了阿拉善型绒山羊（季节性长绒）和敏盖绒山羊（常年长绒）体侧皮肤组织，通过组织切片比较分析组织形态，实时荧光定量PCR法检测chi-miR-107-3p及ADCK5、DSBC1、ARSA、FMAP4、RHBDF2和ALDH3A2等6个相关基因表达量。结果表明：1）两种品系的绒山羊毛囊在形态特征上基本一致，但在同一时期生长规律不同；2)chi-miR-107-3p和RHBDF2基因在两种品系绒山羊皮肤毛囊不同发育周期的表达量呈相反趋势。在次级毛囊重建初期，chi-miR-107-3p表达量较高，而RHBDF2基因的表达量极低，随着次级毛囊重建逐步完成，chi-miR-107-3p表达量显著降低，RHBDF2基因的表达量逐渐增高。进入退行期，chi-miR-107-3p的表达量逐渐增高，而RHBDF2基因的表达量逐渐降低，休止期，chi-miR-107-3p的表达量达到最大值，此时RHBDF2基因的表达量最小，推测chi-miR-107-3p可能负向调控RHBDF2基因的表达；3）相关性分析表明，chi-miR-107-3p和RHBDF2基因表达水平均与皮肤毛囊性状显著相关（P<0.05），说明chi-miR-107-3p和RHBDF2基因均为两品系绒山羊皮肤毛囊生长发育的重要影响因子；4)ALDH3A2基因的表达量在皮肤毛囊休止期至兴盛期的过程中逐渐降低，由退行期至休止期的过程中逐渐增高。ALDH3A2基因与皮肤毛囊各性状均显著相关（P<0.05），表明高表达的ALDH3A2可能抑制两品系绒山羊毛囊的生长发育，是调控皮肤毛囊生长发育的重要影响因子，其他基因对绒山羊皮肤组织生长均无影响。本研究证实羊绒生长发育过程离不开miRNA及其相关基因参与调控，为进一步研究毛囊发育分子机理提供了参考，为实际生产中进行羊绒增产提供理论依据。

为深入探究miR-181a-5p在鹅颗粒细胞中可能的功能及其作用机制奠定基础。以多个网络数据库资源为基础,通过生物信息学的方法预测可能的靶基因及其信号通路,然后利用q PCR检测miR-181a-5p及其靶基因在不同阶段颗粒层中的表达水平。结果显示,miR-181a-5p在脊椎动物中高度保守;靶基因的GO和KEGG分析发现,miR-181a-5p主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程,多数靶基因主要富集到FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路;根据靶基因互作网络图,筛选出10个核心靶基因VEGFA、MAPK1、FOS、KRAS、HRAS、SIRT1、BCL2、ESR1、PTEN和CDKN1A,其中多数靶基因均与细胞增殖凋亡相关。结果表明,miR-181a-5p在2～4 mm表达量最高,但在4～6 mm急剧下降,之后在4～6 mm、8～10 mm、F5这3个阶段均呈现显著上升趋势。miR-181a-5p可能通过靶向调控SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等基因,参与FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路来调控颗粒细胞的增殖凋亡过程。

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响，本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary, CCO)为实验材料，通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下，病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外，将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO，构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示，随着SHVV感染时间及剂量的不断增加，miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明，miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度，而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外，miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达，而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明，miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因，引起G蛋白的降解，从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础，为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验...

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列(pri-mir-14)并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和nega...

【目的】探讨山羊卵巢中富集的miR-100及预测的靶基因与山羊卵巢功能及卵泡发育的潜在关系,为山羊繁殖机理研究提供数据。【方法】以山羊卵巢组织为材料,通过miRNA的分离、克隆及测序得到山羊卵巢中表达的miR-100,采用RT-qPCR进行表达检测,用生物信息学方法预测miR-100的靶基因及其功能。【结果】①山羊卵巢的测序结果中,一段成熟体为21nt的序列与果蝇dan-miR-100高度同源,将其命名为chi-miR-100f-5p,其前体位于基因组负(-)链上,长度为59 bp,定位于山羊CM000899.1:33 997 894—33 997 914序列;②chi-miR-100f-5p...