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[期刊] 西南农业学报
[作者]
马宁 马春霞 黎铭 曾地刚 李旻
刺激隐核虫是危害海水鱼类重要病原,研究刺激隐核虫的入侵机制及阻断剂具有重要的意义。利用基因工程方法克隆并表达凡纳滨对虾C-型凝集素基因Lv CTL3,然后展开重组蛋白对刺激隐核虫凝集作用的研究。实验结果,获得了Lv CTL3基因重组蛋白r-Lv CTL3,凝集相关实验表明,r-Lv CTL3对刺激隐核虫包囊和掠食体均有良好凝集或抑制作用,推测可能与刺激隐核虫包囊或掠食体表面含有丰富的糖蛋白有关。
关键词：
刺激隐核虫 凝集素 糖蛋白
[期刊] 水产学报
[作者]
于金红 潘鲁青 张辉
为研究凡纳滨对虾C-型凝集素的免疫功能,实验利用原核表达系统对凡纳滨对虾C-型凝集素基因的开放阅读框进行了重组表达,并通过纯化分离获得重组目的蛋白,采用血细胞悬浮培养的方法,研究了重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞免疫作用的影响。实验梯度设置为对照组和重组C-型凝集素蛋白(1.0 mg/mL),分别在0、3、6、9、12、24 h取培养的血细胞和培养液进行免疫相关指标的测定。结果表明,重组C-型凝集素经SDS-PAGE分析显示在39 ku处有显著诱导条带,与预测的分子量大小基本一致,Western-blotting分析可以与anti-His抗体特异性结合,从而证明C-型凝集素重组蛋白在大肠杆菌...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王洪乐 齐连芬 杨超沙 吴志明 李亚栋
为了获得新的掌叶半夏凝集素家族基因,以掌叶半夏叶片为材料,根据GenBank中已报道的天南星科凝集素基因序列设计引物,PCR法扩增获得3个掌叶半夏凝集素基因,分别暂命名为PPA15、PPA324、PPA533。其中,PPA15的全长为729 bp,编码243个氨基酸;PPA324的全长为774 bp,编码258个氨基酸;PPA533的全长为777 bp,编码259个氨基酸。利用分析软件和网站等工具对克隆的3个基因进行生物信息学分析,结果显示,PPAs与GenBank中收录的天南星科半夏基因具有较高同源性,
关键词：
掌叶半夏 凝集素 载体构建 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
付国良 黄玛娇 谢金珠 胡燕红 晏燕花 黄镇 黄晓红
对刺激隐核虫（ＣｒｙｐｔｏＣａｒｙｏｎ ｉｒｒｉｔａｎｓ）的小Ｇｔｐ酶ｒａｎ基因（Ｃｉ ｒａｎ）进行研究，以期为刺激隐核虫病原生物学研究及其防治提供理论基础。从刺激隐核虫滋养体／包囊前期ＣＤｎａ文库中筛选出Ｃｉ ｒａｎ基因的克隆，利用生物信息学方法对Ｃｉｒａｎ基因及其编码的蛋白进行结构与功能的预测；通过逆转录ｐＣｒ检测Ｃｉｒａｎ的ｍｒｎａ。结果表明其在刺激隐核虫的各个发育阶段均有表达。对Ｃｉｒａｎ基因开放阅读框内的非通用密码子进行改造，并构建重组质粒ｐ ＧＥＸ－４ｔ－１／Ｃｉｒａｎ，将其转化到大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）后成功表达分子量为５１．３ ｋＤ的重组融合蛋白ｒＣｉｒａｎ。用ｒＣｉｒａｎ蛋白．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙嘉阳 张子平 朱友芳 邹志华 韩坤煌 葛辉 王艺磊
从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段,利用5’RACE和3’RACE技术首次克隆获得其cDNA,全长为1602 bp,包含1356 bp的开放阅读框,编码451个氨基酸,预测蛋白质分子量为49.78 kD。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白,氨基酸序列的第142～148位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG)。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%～95%,且在系统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史阶段的表达进行检测,结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P
[期刊] 水产学报
[作者]
孙盛明 傅洪拓 宣富君 戈贤平 朱健 吴旭干
C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
于金红 潘鲁青
通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素(C-type lectin like-domain protein,CTLD)基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验。结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量(M)39 600的目的蛋...
[期刊] 水产学报
[作者]
李丹彤 谢广成 丁文勇 王秀利 刘洋 徐文琦 张永攀
为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni2+离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集...
[期刊] 水产学报
[作者]
张东玲 喻达辉 陈健 叶坤 王志勇
为探究大黄鱼ＭＡＲＣＨ５Ａ的免疫作用，实验采用反转录ＰＣＲ确认了该基因的Ｃ ＤＮＡ序列。该序列全长１０４５ ｂＰ，包含１个长度为８６７ ｂＰ的开放阅读框，编码２８８个氨基酸；序列分析显示该蛋白含１个ＲＩＮＧｖ和４个跨膜结构域。进化树分析表明大黄鱼有１１个ＭＡＲＣＨ家族蛋白（与哺乳动物相同），但鱼类存在多个亚型，ＭＡＲＣＨ５Ａ为鱼类特有蛋白，其蛋白理化性质和三维结构均与ＭＡＲＣＨ５ｂ存在一定的差异。荧光定量ＰＣＲ分析显示，ＭＡＲＣＨ５Ａ在健康大黄鱼的多个组织中均有表达，在血液和心脏中表达量最高，其次为鳃和脑，而在肾脏和皮肤中表达量最少。刺激隐核虫感染大黄鱼后，ＭＡＲＣＨ５Ａ在皮肤中早期表达量显著．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
汤雨洁 田祥瑞 胡波 黄河 薛圆 苏建亚
[目的]采用原核表达技术对甜菜夜蛾的黄素单加氧酶(FMO)进行体外表达,获得具有活性的FMO酶,在此基础上开展对杀虫剂的代谢功能研究。[方法]通过将甜菜夜蛾FMO基因的开放阅读框构建到pET32a原核表达载体中,在大肠杆菌中表达目的蛋白,利用该载体的His标签使用镍柱对表达蛋白进行纯化,再通过咪唑梯度洗脱得到纯化的重组FMO酶蛋白。采用还原型辅酶Ⅱ(NADPH)法测定FMO酶的活性以及对杀虫剂的氧化活性,并用HPLC法分析FMO酶催化杀虫剂降解的能力,最后用液质联用技术鉴定代谢产物。[结果]通过原核表达技术成功得到可溶性的SeFMO2与SeFMO3酶,这2种酶对FMO的模式底物甲巯咪唑与苄达明均具有氧化活性,SeFMO2与SeFMO3对甲巯咪唑S-氧化的代谢动力学参数K_m值分别为37.59与3.00μmol·L~(-1),对苄达明N-氧化的K_m值分别为165.98与17.71μmol·L~(-1)。对模式底物的S-氧化活性与N-氧化活性均是SeFMO3高于SeFMO2,2种酶的S-氧化活性均高于N-氧化活性。SeFMO2和SeFMO3对毒死蜱、硫双威以及溴虫腈具有一定的代谢活性,HPLC分析表明这2种FMO酶均能催化这3种杀虫剂的氧化降解,SeFMO2对毒死蜱、溴虫腈和硫双威的降解率依次是11.8%、11.5%和27.8%,SeFMO3对它们的降解率分别是28.8%、23.1%和30.2%,其中对硫双威的降解作用较强。对硫双威代谢产物的鉴定表明:FMO主要催化硫双威的硫醚氧化,形成硫双威的砜化合物。[结论]甜菜夜蛾黄素单加氧酶对外源物具有S-氧化活性与N-氧化活性,对某些杀虫剂具有氧化代谢能力,是昆虫的重要解毒酶系之一。
[期刊] 华北农学报
[作者]
任瑛 赵美爱 郭新梅 裴玉贺 宋希云
为了研究冷胁迫处理下的玉米抗坏血酸过氧化物酶的作用,根据GenBank发表的APX基因的ORF序列设计引物,利用RT-PCR从冷胁迫后的玉米自交系(E28)叶片总RNA中经cDNA转化,pMD19-T载体的亚克隆,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基。生物信息学分析显示,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.3 kDa和5.56。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,APX基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小约为27.3 kDa,与预测结果一致。抗盐分析显示,重组大肠杆菌BL21(pET28-APX)的抗...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
遇文婧 宋小双 邓勋 平晓帆 周琦 刘志华
【目的】研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能,为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。【方法】从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1,并进行序列分析和原核表达,将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作,初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。【结果】刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417bp,预测蛋白分子量12.6 kDa,属于Cerato-platanin家族;通过构建
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李彩丽 彭镇华 高志民
作为细胞骨架的重要组成部分,微管蛋白在细胞壁发育过程中起着重要的调控作用。采用RT-PCR技术从毛竹叶片中克隆到一个微管蛋白(Tua3)同源基因的cDNA序列,长1 356 bp,编码451个氨基酸,命名为PeTua3。构建原核表达载体pET-32b-PeTua3,并将其转入大肠杆菌中诱导表达。蛋白电泳检测结果表明:温度和诱导时间对PeTua3基因蛋白的表达影响差异显著,其中,在37℃用0.4 mmol.L-1IPTG诱导2 h的表达效果最好。用PeTua3基因体外表达的重组蛋白处理拟南芥种子,其幼苗上胚轴明显增粗,侧根增多;超薄切片显微观察显示,重组蛋白处理的拟南芥上胚轴和主根的薄壁细胞数量...
[期刊] 水产学报
[作者]
李常健 刘军 桂建芳
采用RACE-PCR技术结合SMART cDNA合成技术,从银鲫中克隆到Ran的全长cDNA并对其编码区全长进行了原核表达、相应抗体制备及其时空表达特征分析。RT-PCR结果表明,Ran基因除在脑组织的转录水平较低外,其它组织中的转录水平几乎相同;Ran基因在不同发育阶段的胚胎中都有mRNA转录,但其mRNA的量在原肠期以后呈下降趋势。Western blot结果表明,Ran在卵巢和精巢中均高水平表达,在心、脑、肝、脾、肾中有较低水平表达,在肌肉中则不表达。同时检测到Ran在不同胚胎发育阶段均有较强表达。这表明,Ran基因在银鲫中可能起着多种作用,尤其在生殖细胞的发生中具有重要作用。最后,采用...
关键词：
银鲫 Ran 时空表达 精核解凝
[期刊] 中国水产科学
[作者]
马骞 柳淑芳 庄志猛 唐启升
根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSG...
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