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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵洁 史陈博 杨花 王锋 张艳丽
[目的]探究lncRNA-NAS对湖羊睾丸间质细胞（LCs）睾酮分泌的影响。[方法]首先利用qRT-PCR对湖羊lncRNA-NAS进行组织表达谱分析；然后利用ELISA、Western blot、CCK-8、qRT-PCR等技术分析其干扰lncRNA-NAS对睾丸间质细胞睾酮分泌、细胞增殖和凋亡的影响；并在前期测序结果上对lncRNA-NAS可能作用的靶基因进行分析。[结果]lncRNA-NAS在湖羊心脏、肝、脾、肾、空肠、睾丸组织中均有表达，但其在睾丸中的表达量显著高于其它组织（P0.05）；相比对照组，干扰lncRNA-NAS后，睾丸间质细胞中睾酮分泌水平显著升高（P<0.05），睾酮分泌相关基因和蛋白表达量显著升高（P<0.05），细胞增殖活力增强（P<0.05）；通过分析lncRNA-NAS潜在的9个靶基因，其中有2个为未知基因，后续针对7个已知基因进行研究，当lncRNA-NAS干扰后，发现只有生殖细胞发育相关基因Nanos3表达水平发生变化，表现为显著升高（P<0.05），结果提示其可能为lncRNA-NAS作用的靶基因Nanos3。[结论]lncRNA-NAS可能通过调控靶基因Nanos3影响湖羊睾丸间质细胞睾酮的分泌。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘亮 苏晓彤 李慧贤 胡康瑶 陆宏辉 许新松 万永杰
[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)对湖羊睾丸间质细胞(leydig cells, LC)的毒性作用。[方法]用200μmol·L~(-1) ZEA处理湖羊LC 8 h,通过EdU法检测细胞增殖情况，RT-qPCR和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m~6A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LC活性和增殖数量极显著下降(P<0.01);细胞增殖相关基因pcna及其蛋白表达水平均极显著下降(P<0.01);促凋亡基因表达水平(bax、caspase3,P<0.01;tp53、caspase9,P<0.05)均显著升高，相对应蛋白表达水平(TP53、CASPASE9,P<0.01)极显著升高；抗凋亡基因bcl-2及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);氧化应激相关基因相对表达水平(cat,P<0.05;gsh-px、sod2,P<0.01)显著或极显著上升，其相关蛋白表达水平(SOD2,P<0.01)极显著上升；m~6A相关基因alkbh5的相对表达水平显著降低(P<0.05),mettl3和ythdc1水平极显著升高(P<0.01),ythdf3水平显著升高(P<0.05)。[结论]ZEA可抑制湖羊LC增殖，促进湖羊LC凋亡，导致LC发生氧化损伤，产生毒性作用，且其毒性作用可能跟m~6A甲基化修饰相关。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏晓彤 李慧贤 胡康瑶 刘亮 万永杰
[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEA）对湖羊睾丸间质细胞（Leydig cells， LCs）的毒性作用。[方法]试验采用湖羊LCs为试验材料，用200 μmol·L~(-1) ZEA 处理8 h，通过Edu法检测细胞增殖情况，qRT-PCR 和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m~(6)A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LCs细胞活性和细胞增殖数量极显著下降（P＜0.01）；细胞增殖相关基因pcna相对表达量及其相关蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01）；促凋亡基因相对表达量升高（bax、caspase3，P＜0.01；tp53、caspase9，P＜0.05），其相关蛋白表达水平升高（TP53、CASPASE9，P＜0.01）；抗凋亡基因bcl-2相对表达量及其相关蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；氧化应激相关基因相对表达量上升（cat，P＜0.05；gsh-px、sod2，P＜0.01），其相关蛋白表达水平上升（SOD2，P＜0.01）；m~(6)A相关基因的相对表达量alkbh5显著降低（P＜0.05）、mettl3和ythdc1极显著升高（P＜0.01）、 ythdf3显著升高（P＜0.05）。[结论]ZEA可抑制湖羊LCs增殖、促进湖羊LCs凋亡，导致LCs发生氧化损伤，产生毒性作用，且其毒性作用可能跟m~(6)A甲基化修饰变化相关。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
冯健豪 刘怀瑾 唐梓宁 王水莲 杨闯
分别用质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的铁皮石斛提取物处理小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞) 24 h，采用细胞增殖检测试剂盒(MTS)检测细胞活力；qRT–PCR检测增殖与凋亡相关基因、睾酮合成酶基因、睾酮合成酶相关转录因子及其上游调控因子的mRNA表达水平；Western blot检测凋亡相关基因、睾酮合成酶的蛋白表达水平；ELISA法检测TM3细胞睾酮分泌水平。结果表明：与不加铁皮石斛提取物的对照组比较，40 μg/mL铁皮石斛提取物处理TM3细胞，显著提高了其增殖活力；细胞增殖相关基因Ki–67和PCNA mRNA表达水平、抗凋亡基因Bcl–2 mRNA表达水平、Bcl–2蛋白表达水平、睾酮合成酶基因StAR、P450scc、3β–HSD、CYP17a1和17β–HSD mRNA表达水平、P450scc、CYP17a1和17β–HSD的蛋白表达水平、睾酮合成酶相关转录因子Nur77和SF–1 mRNA表达水平均极显著高于对照组的；BAX和Caspase–3蛋白表达水平、NF–κB mRNA和蛋白表达水平极显著低于对照组的；其上游调控因子CREB MT3细胞睾酮浓度显著高于对照组的。说明40 μg/mL铁皮石斛提取物可通过调控睾酮合成酶基因及其相关转录因子的表达促进睾酮的合成。
关键词：
铁皮石斛提取物 小鼠间质细胞 睾酮合成
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
冯健豪 刘怀瑾 唐梓宁 王水莲 杨闯
分别用质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的铁皮石斛提取物处理小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞) 24 h，采用细胞增殖检测试剂盒(MTS)检测细胞活力；qRT–PCR检测增殖与凋亡相关基因、睾酮合成酶基因、睾酮合成酶相关转录因子及其上游调控因子的mRNA表达水平；Western blot检测凋亡相关基因、睾酮合成酶的蛋白表达水平；ELISA法检测TM3细胞睾酮分泌水平。结果表明：与不加铁皮石斛提取物的对照组比较，40 μg/mL铁皮石斛提取物处理TM3细胞，显著提高了其增殖活力；细胞增殖相关基因Ki–67和PCNA mRNA表达水平、抗凋亡基因Bcl–2 mRNA表达水平、Bcl–2蛋白表达水平、睾酮合成酶基因StAR、P450scc、3β–HSD、CYP17a1和17β–HSD mRNA表达水平、P450scc、CYP17a1和17β–HSD的蛋白表达水平、睾酮合成酶相关转录因子Nur77和SF–1 mRNA表达水平均极显著高于对照组的；BAX和Caspase–3蛋白表达水平、NF–κB mRNA和蛋白表达水平极显著低于对照组的；其上游调控因子CREB MT3细胞睾酮浓度显著高于对照组的。说明40 μg/mL铁皮石斛提取物可通过调控睾酮合成酶基因及其相关转录因子的表达促进睾酮的合成。
关键词：
铁皮石斛提取物 小鼠间质细胞 睾酮合成
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王帅 贾琦珍 张玲 王连群 陈根元
【目的】研究和田羊睾丸支持细胞的体外培养特性。【方法】取新生和田羊睾丸组织,利用两步酶消化后,采用差速贴壁法纯化细胞进行体外培养,并通过形态学观察、HE染色、AKP染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫组化染色、RTPCR和MTT法检测细胞活性及纯度。【结果】培养基中加入2.00%血清浓度的DMEM/F-12可提高支持细胞纯度,在体外培养传至20代的和田羊睾丸支持细胞形态和核型均为正常;所培养的细胞内波形蛋白表达及标志基因SCF和GDNF的表达均为阳性。【结论】本试验成功建立了和田羊睾丸支持
关键词：
和田羊 睾丸 支持细胞 体外培养 鉴定
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨倩 包涛涛 鲜思美 张友 梁倩 顾庆林
为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株，利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆，并鉴定文库质量.结果显示：LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功，其文库滴度为2.33×10~8 CFU·mL~(-1),文库容量达3.5×10~9 CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为250～2 000 bp,平均大小约为1 000 bp,文库重组率达100%.由此表明，本文库达到高质量文库条件，可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王菊花 刘丹丹 刘琦 王佳明 董静 周杰 薛秀恒
为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P
关键词：
山羊 支持细胞 分离和培养 氧化应激
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
安世钰 张国敏 尤佩华 孟繁星 刘建玲 张婷婷 杨花 樊懿萱 王锋
[目的]本试验旨在探究PPARGC1A/NRF1/TFAM通路核心基因在湖羊性成熟前后的表达变化。[方法]选取体况良好和系谱清楚的雄性湖羊18只(3和9月龄,各9只),颈静脉采血后进行阉割处理。ELISA检测血样中睾酮(T)、瘦素、胰岛素及胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的浓度;免疫组化法检测睾丸组织中PPARGC1A/NRF1/TFAM通路相关蛋白的表达定位; RT-qPCR和Western blot检测睾丸组织中PPARGC1A/NRF1/TFAM通路相关基因与蛋白的表达变化。[结果]与3月龄湖羊相比,9月龄湖羊外周血中T、瘦素、胰岛素及IGF-Ⅰ的浓度显著升高(P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
夏雨婷 万永杰 姜志洋 陈琪 茆达干
[目的]本研究旨在探究夏季日粮添加酵母硒对湖羊血液指标和睾丸发育的影响，解析酵母硒影响睾丸功能的潜在分子机制。[方法]将96只4月龄雄性湖羊按体重相近原则分为对照组（Con，基础日粮）和酵母硒组（Se，基础日粮+酵母硒0.4 g·kg~(-1)）。预试期1周，正试期4周，记录体重变化；收集血液检测生化、抗氧化与免疫相关指标；采集睾丸组织，测量质量和大小及其硒浓度，HE染色观察组织学形态（HE），转录组测序（RNA-seq）分析差异基因。[结果]Se组平均日增重显著高于Con组（P0.05），但Se组睾丸中硒浓度极显著高于Con组（P<0.01）。与Con组相比，Se组血清游离脂肪酸（NEFA）浓度显著升高（P<0.05），血浆IgA、IgG和IgM浓度极显著升高(P<0.01)，血清和睾丸组织中GSH-Px活性均极显著升高(P<0.01)。HE结果显示生精小管中有精子出现，Se组生精细胞排列更紧密且生精上皮厚度极显著增加（P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
舒嘉傲 曹少先 孟春花 钱勇 张俊 张建丽 丁强 李隐侠 李齐发
[目的]本文旨在研究 lncRNA-269序列特征、表达模式和转录调控，为后续开展lncRNA-269的功能研究提供理论基础。[方法]以湖羊为研究对象，采用5'/3' RACE结合PCR扩增方法获得其序列全长，利用RT-qPCR方法鉴定其在湖羊组织中的表达模式，并利用PCR方法扩增其启动子区，鉴定其启动子区特征，分析其转录调控情况。[结果]湖羊lncRNA-269全长3 146 bp，组织表达谱显示其在湖羊各组织中广泛表达，且在健康卵泡中显著高表达， 其表达水平与NR5A1 mRNA水平和血清中E_(2)水平呈正相关。荧光素酶活性分析发现在其启动子区的-359 nt ～ -17 nt之间有一个转录激活基序，在-1 485 nt ～ -941 nt之间有一个转录抑制基序。JASPAR软件预测发现在lncRNA-269转录抑制启动子区域存在FOXO3、PDX1等转录因子结合位点，在转录激活区域有SMAD4、YY1等转录因子结合位点。过表达SMAD4可显著提升lncRNA-269启动子区荧光素酶活性，染色质免疫沉淀（ChIP）试验进一步确认了SMAD4特异性与lncRNA-269启动子区结合。[结论]湖羊lncRNA-269在健康卵泡中显著高表达，其启动子区存在一个转录激活区域和一个转录抑制区域，转录因子SMAD4可通过与lncRNA-269启动子区结合显著上调lncRNA-269的启动子活性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔庆学 张涌
采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。
关键词：
未成年大鼠 睾丸支持细胞 分离纯化
[期刊] 西南农业学报
[作者]
高艺 黄泳 冯贤辀 王维勇 徐永健 龚婷
【目的】研究建立一种高效制备从江香猪睾丸支持细胞（Sertoli cells，SCs）体外分离培养方法，为后续香猪雄性繁殖的科学研究提供细胞材料，为同类小型香猪支持细胞的分离培养提供参考。【方法】采用0.1% Ⅳ型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA组合酶消化法消化睾丸组织，差速贴壁法纯化支持细胞，使用含10%胎牛血清完全培养基培养支持细胞，观察其形态特征并记录生长曲线，经苏木精-伊红（HE）染色、RT-PCR及免疫荧光染色进行支持细胞的鉴定。【结果】组合酶法消化后可获得大量生精上皮细胞混悬液，刚分离的支持细胞呈圆形或椭圆形，分离培养5～6 h后SCs贴壁，贴壁后细胞形态呈梭形或不规则形，培养3～4 d后细胞之间呈紧密连接，可清晰观察到细胞核及细胞质中的颗粒状物质或小空泡；SCs分离后1～2 d增殖速度缓慢，培养3～6 d细胞增殖速度加快，活性增强，进入对数生长期，培养7～8 d后细胞增殖速率下降，原代支持细胞生长曲线呈S形；HE染色显示SCs细胞核为深紫色，细胞质呈淡红色；RT-PCR结果显示支持细胞特异性基因WT1、SOX9均表达；免疫荧光染色结果显示特异性基因GATA-4抗体免疫阳性率达90%以上。【结论】成功建立从江香猪睾丸支持细胞的原代培养方法。
关键词：
睾丸支持细胞 分离培养 鉴定 从江香猪
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈培勇 蔡玉 杨花 徐辉 王锋 张艳丽
[目的]本研究旨在探究神经营养因子酪氨酸激酶B受体（Trkb）对湖羊垂体促性腺激素分泌的影响。[方法]利用qPCR方法对Trkb进行组织表达谱分析；构建Trkb过表达载体并转染至湖羊垂体细胞，利用qPCR、Westernblot、EdU以及ELISA等实验技术检测过表达Trkb对垂体细胞增殖及促性腺激素分泌的影响。[结果]Trkb在湖羊心、肝、脾、肺、肾以及下丘脑和垂体等各个组织中均有表达，但在垂体中表达水平显著高于其他组织（P<0.05）。Trkb在湖羊垂体组织不同发育阶段差异表达，其中在6月龄垂体组织中高表达（P<0.05），在5日龄和3月龄表达水平较低。与对照组相比，过表达Trkb基因显著促进了垂体细胞增殖率（P< 0.05）。[结论]过表达Trkb能够显著促进湖羊垂体细胞增殖，降低细胞凋亡水平从而显著提高促性腺激素的分泌水平。本研究初步验证Trkb在湖羊垂体细胞中功能，为深入研究Trkb调控垂体功能的分子机制提供了理论基础。
[期刊] 草业科学
[作者]
刘佳美 路婷婷 姚婷 要荣宇 李发弟 乐祥鹏 李万宏
为深入了解不同阴囊围度的湖羊公羔类固醇激素生成和曲细精管生精环境差异,本研究选择137只165日龄湖羊公羔作为试验对象,根据阴囊围度大小分成小围度组[S组,(18.53±0.42) cm]和大围度组[L组,(27.29±1.13)cm],每组9只,共18只。结果表明:1) L组的睾丸重量、睾丸体积、睾丸系数、附睾重量、曲细精管直径、附睾尾部精子数量均极显著高于S组(P
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