【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段(GenBank登录号:EU755368.1),运用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cNDA ends,RACE)技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、放线菌酮(cycloheximide)刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWR...

[目的]本文旨在通过克隆菊花中的乙烯受体基因(CmETR2),分析其表达特征并转入拟南芥中对其调控开花的功能进行研究。[方法]以菊花品种‘神马’为试验材料,克隆CmETR2全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,利用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的相对表达量,以及其对外源乙烯处理后的响应变化。将CmETR2超表达转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,分析转基因拟南芥中开花相关基因的表达量变化。[结果]克隆获得的CmETR2基因开放阅读框(ORF)全长为2 292 bp,编码氨基酸763个。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与向日葵的ETR3(XP_022030036.1)和刺菜蓟的ETR2-like(XP_024986908.1)亲缘关系最近。组织特异性定量表达分析结果表明,CmETR2在菊花营养生长期间茎和叶中表达量最高,生殖生长期间管状花和根中的表达量较高。亚细胞定位结果表明,CmETR2定位在细胞膜上。外源乙烯处理后3 h CmETR2基因表达量最高。CmETR2超表达植株的开花时间比野生型拟南芥晚3～4 d,开花时莲座叶片数比野生型拟南芥多3片左右。CmETR2超表达植株对乙烯的敏感性增强并表现出更明显的三重反应。在CmETR2超表达植株中,促进开花的基因AtGI、AtSPL3和AtFD在CmETR2超表达植株中的表达量较野生型下降,抑制开花的基因AtFLC和AtTFL在CmETR2超表达植株的表达量上调。[结论]本研究克隆得到菊花CmETR2基因具有延迟拟南芥开花的功能。

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。Pd PP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受Na Cl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转Pd PP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明Pd PP2...

【目的】克隆水稻镉（Cadmium，Cd）响应基因OsGLP1-2，并对其进行生物信息学及Cd胁迫处理的表达模式分析，为探索OsGLP1-2基因在水稻中应对重金属胁迫的分子机制提供基础。【方法】以水稻为材料，利用PCR克隆OsGLP1-2基因，并利用生物信息学方法对其顺式作用元件、二级结构和疏水性等进行分析，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在100 μmol/L Cd处理下，水稻茎部和根部中的表达特征，再利用转基因酵母进行Cd耐受性分析。【结果】水稻OsGLP1-2基因编码区（CDS）序列长度为651 bp，编码216个氨基酸，其编码蛋白的相对分子量为22.48 kDa，理论等电点（PI）为7.16，为稳定性的中性疏水性蛋白，含有Cupin结构域，属于Cupin家族，该家族在植物防御等方面发挥着重要作用。同源家族进化树表明该基因是单独的一支，但与大麦HvGER5a的亲缘关系最为接近，表明OsGLP1-2可能具有HvGER5a类似的功能。二级结构分析结果表明该蛋白含有10个β折叠、8个α螺旋和17个无规卷曲结构。并且OsGLP1-2具有光、干旱等环境诱导相关的调节元件以及生长素、赤霉素和茉莉酸甲酯等激素相关调节元件，表明目的基因可能参与水稻对非生物胁迫的响应。100 μmol/L Cd处理下，在6 h时地上部分目的基因的表达水平约为对照组3倍，且地下部分也为对照组的3倍，即OsGLP1-2基因能对Cd产生响应。最后斑点实验表明该基因在酵母中无明显表型。【结论】成功克隆了水稻OsGLP1-2基因，且该基因对Cd有一定的响应，可为水稻应对重金属胁迫的反应机制提供参考依据。

为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C_(1116)H_(1788)N_(310)O_(335)S_3,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导和大量诱导均有点突变后的His-AtCaN2(M)融合蛋白表达,且纯化后得到了点突变His-AtCaN2(M)较单一的条带;蛋白酶活性分析表明,His-AtCaN2融合蛋白对核酸底物具有降解能力,表现出较高的活性,而His-AtCaN2(M)点突变融合蛋白对核酸底物没有降解能力,底物基本上未降解。研究结果可以为下一步在植物体内研究AtCaN2基因的相关机理作用提供基础。

[目的]DET2基因编码一个5α-还原酶,是油菜素内酯(BRs)合成过程中的关键限速基因。研究DET2基因在杨树生长发育中的作用,对于进一步研究油菜素内酯在木本植物中的调控机制有重要意义。[方法]从银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa,‘84K’)克隆得到拟南芥AtDET2同源基因PagDET2,利用生物信息学对其进行序列比对、生化特征分析、构建系统发育进化树。通过RT-PCR分析其在杨树中的表达模式。构建由CaMV 35S强启动子驱动的过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化84K杨,得到PagDET2-OE转基因植株。分析过表达DET2基因对于转基因植株内源BRs含量、植株生长和抗逆的影响。[结果]克隆了包含全长编码区PagDET2基因全长,可编码一个长度为257个氨基酸的蛋白质。其蛋白序列与毛果杨、拟南芥、水稻、棉花、大豆、番茄DET2蛋白同源性较高,说明该基因在进化过程中相对保守。PagDET2在84K杨不同组织中均检测到表达,其在茎中的表达较高。通过ELISA检测植物BRs含量发现,过量表达DET2可以显著提高杨树内源BRs含量。过量表达DET2基因,可以导致转基因植株的高生长,但对盐胁迫更加敏感。[结论]DET2基因作为BRs合成的关键基因,在杨树中过量表达可以显著提高内源BRs含量,促进植株增高。DET2转基因植株的获得为进一步分析BR参与木本植物生长发育的调控机制奠定了基础。

【目的】对大豆(Glycine max)水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为Gm SABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在...

[目的 ]研究MYB转录因子家族在毛竹干旱胁迫反应中的重要作用，为毛竹的抗逆改良和分子育种提供基因资源。[方法 ]从毛竹的基因组数据库中获得PheMYB2R-4的基因序列，利用亚细胞定位和转录活性实验分析基因的分子特性、通过实时荧光定量PCR技术、转基因拟南芥表型分析和逆境相关生理生化指标的测定来确定PheMYB2R-4基因的功能。[结果]毛竹中PheMYB2R-4编码1个305个氨基酸的蛋白PheMYB2R-4，其N端区域有一个保守的R2R3区域，属于R2R3-MYB亚家族。PheMYB2R-4基因的表达受到干旱和盐的显著诱导。PheMYB2R-4是一个核定位蛋白，具转录自激活活性。PheMYB2R-4的过表达提高了干旱胁迫下拟南芥的叶片相对含水量，降低了相对电导率并减少了丙二醛的积累，说明过表达PheMYB2R-4通过提高拟南芥的保水能力和减少氧化损伤来增强转基因拟南芥的耐旱性；同时干旱胁迫下，AtRD22、AtRD29A、AtDREB2A和AtLEA基因的表达量均上调。[结论 ]MYB转录因子家族中PheMYB2R-4在干旱胁迫应答反应中具有正调控作用，可以提高植物的耐旱性，增强干旱响应基因的表达量。

【目的】AtRPL是拟南芥果实发育调控网络中的重要基因,参与胎座框的形成。同源克隆黄瓜的RPL,进行表达模式分析,在拟南芥中异源过表达CsRPL,探究CsRPL的生物学功能。【方法】根据拟南芥AtRPL信息在黄瓜基因组数据库中比对,克隆得到黄瓜CsRPL;利用MEGA5.2对CsRPL与其他物种同源蛋白进行氨基酸序列比对;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及原位杂交技术检测CsRPL在黄瓜中的表达模式;在拟南芥中异源表达CsRPL,并对转基因植株进行表达和表型分析。【结果】在黄瓜中存在两个RPL,分别命名为CsRPL1和CsRPL2,均含有BELL-Domain、Homeodomain保守域和两个EAR-Motif。CsRPL1在黄瓜各个部位均有表达,在开放的雄花中表达量最高,且在果实生长前期,其表达量随着果实的发育逐渐降低;CsRPL2在黄瓜各部位表达量均显著低于CsRPL1。原位杂交显示CsRPL1/2在黄瓜果实的胎座框中表达,且杂交信号在茎尖分生组织(SAM)的Central zone(CZ)区域富集。拟南芥异源过表达CsRPL1/2转基因植株的果荚变短,花粉育性降低,且种子发育受到抑制。【结论】CsRPL1/2参与生殖器官的发育,且可能存在功能冗余,在正常生长条件下,CsRPL1优先发挥功能。相比于AtRPL,CsRPL1/2的功能并不完全保守。

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)...

利用PCR技术,从毛白杨花序材料中分离出一个MADS盒基因PtSEP3。蛋白序列比较和同源树分析表明,该基因与拟南芥SEP3同源。表达分析显示PtSEP3不仅在成年植株雌蕊和雄蕊中表达,也在幼茎、幼叶和顶芽中表达。在35S启动子驱动下,PtSEP3超表达的毛白杨转基因植株发生了明显的形态变化,表现为叶序不规则,在同一节间常数枚集生;并且叶片基部形态与野生型的心形不同,大部分为楔形。在离体条件下,在芽分化培养基上,PtSEP3转基因株系的根和叶外植体可以诱导发生带有花柱和子房室的子房状结构。试验结果说明PtSEP3参与了毛白杨花器官的发生,并可能在维持茎端分生组织分化出正常形态的叶片中也起着作用...

毛竹(Phyllostachys edulis)是中国最重要的经济竹种之一,适宜的条件下,竹笋能够在短时间内从0 m长到20 m,经组织解剖发现,这一过程包括细胞分裂和细胞伸长。对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)等的研究发现:赤霉素(gibberellic acid,GA)和生长素(indole-3-acetic acid,IAA)在促进植物细胞分裂和伸长方面具有重要功能。IAA早期响应基因SAUR在促进细胞伸长方面发挥了重要作用;GA途径中的转录因子DELLA蛋白通过参与调控下

【目的】探究大豆核因子Gm NF-YA13基因在大豆应对非生物胁迫中的生物学功能,为Gm NF-YA13基因在抗逆育种中的应用奠定基础。【方法】以大豆北豆9号和烟草NC89的种子为供试材料,将大豆培养至第一片三出复叶展开后,分别进行干旱、高盐、低温和脱落酸(ABA)处理,通过实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)对Gm NFYA13在以上4种非生物胁迫下的相对表达量进行检测,并对Gm NF-YA13进行克隆及生物信息学分析,将Gm NFYA13转化烟草,并对转基因烟草中抗逆相关基因(Nt ABA2、Nt Osmotin、Nt APX2、Nt SOD、Nt CAT1和Nt Ca MK3)的表达量进行q RT-PCR检测。【结果】干旱、高盐、低温和ABA处理均能不同程度诱导Gm NF-YA13的表达,其中干旱胁迫和ABA处理对Gm NF-YA13的诱导效果尤为显著。Gm NF-YA13位于大豆基因组13号染色体,开放阅读框915 bp,编码含有304个氨基酸的蛋白质,该蛋白质分子量75.14 ku,等电点5.10。Gm NF-YA13蛋白序列包含一个保守的DNA结合结构域。蛋白系统进化分析结果表明,Gm NF-YA13与Gm NF-YA7和拟南芥At NF-YA1亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测分析结果表明,Gm NF-YA13启动子区含有3个ABA响应元件ABRE、1个厌氧诱导元件ARE、1个防御和胁迫反应元件TC-rich repeats及1个干旱诱导的MYB转录因子结合位点MBS。Gm NFYA13在大豆叶片中的相对表达量最高。同时构建Gm NF-YA13植物表达载体,并将Gm NF-YA13转化烟草,获得3株转基因烟草植株。转基因烟草中抗逆相关基因表达量检测结果显示,转基因烟草中的Nt ABA2、Nt Osmotin和NtAPX2相对表达量均显著高于野生型烟草,转基因烟草中Nt SOD、Nt CAT1和Nt Ca MK3的相对表达量与野生型烟草差异不显著。【结论】Gm NF-YA13与大豆干旱、高盐、低温等非生物胁迫之间关系密切,Gm NF-YA13可能通过促进抗逆相关基因表达量的升高以提高转基因烟草的抗逆性。

【目的】核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是参与植物光合作用的第1步碳同化的关键酶,而Rubisco活化酶(RCA)能够使Rubisco处于稳定的催化活性状态,从而提高光合效率。本研究从毛果杨中克隆RCA基因并通过遗传转化南林895杨,获得PtRCA高表达的转基因株系,并进行分子检测及相关功能分析,为培育杨树新型高光效抗逆品种提供依据。【方法】基于毛果杨基因组数据库信息克隆PtRCA基因序列,利用生物信息学对PtRCA基因进行功能和结构分析。采用Gateway技术将PtRCA构建到植物表达载体

采用RACE技术,从银杏中获得MEP途径中的第5个酶2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(IspF)基因的全长cDNA,命名为GbIspF(GenBank登录号:EF062579)。该基因cDNA全长为897bp,包含720bp的开放阅读框,编码239个氨基酸残基的蛋白,在GbIspF的N-端有一个长为59个氨基酸残基的质体转运肽;序列多重比对表明GbIspF与其他植物IspF同源。利用半定量RT-PCR对GbIspF进行组织表达谱分析,结果表明GbIspF在银杏根、茎、叶、果中均有表达,但表达量差异较大,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。功能互补分析表明GbIspF能推动工程菌...