【目的】由于LBD基因编码一类植物特有的空间结构尚未解析的转录因子,拟建立2种LBD家族成员(TtRa2和AtLBD37)及其DNA结合结构域的高效表达与纯化体系,为该家族转录因子的结晶研究奠定基础。【方法】以pET-21a表达载体为基架,设计并构建了pHMT载体,该载体在目标基因上游依次融合了His-tag、MBP和TEV蛋白酶酶切位点。将TtRa2和AtLBD37基因的完整编码区及其DNA结合结构域编码区分别插入pHMT载体,获得重组质粒pHMT-AtLBD37、pHMT-AtLBD37-BD、pHMT-TtRa2、pHMT-TtRa2-BD。将上述质粒导入E.coli表达菌株2566诱导...

为了解苋菜LBD基因家族,本研究利用转录组数据筛选和鉴定苋菜LBD基因家族成员,并命名为AtrLBD。结果表明:1)从‘全红’苋菜转录组中共鉴定得到16个AtrLBD基因,均为不稳定蛋白,氨基酸长度在91～351aa,相对分子质量为9.396～38.250ku;二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主;亚细胞定位预测,AtrLBD定位在细胞核、叶绿体和线粒体;MEME分析结果表明,16个AtrLBD共有10个保守氨基酸序列;2)系统进化树显示,16个AtrLBD与拟南芥LBD蛋白分为第一类(ClassⅠ)和第二类(ClassⅡ)2大类,细分为Class Ia、Ib、Ic、Id、Ie和Class IIa、IIb等7个亚类;miRNA预测结果显示,有4个AtrLBD是miRNA靶基因;3)qRT-PCR结果显示,除AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD10和AtrLBD16以外,AtrLBD均受到蓝光的诱导表达。上述结果为深入研究苋菜LBD基因家族的功能及进化分析奠定了基础。

【目的】通过生物信息学分析明确LBD转录因子在葡萄基因组中的数量、结构和非生物胁迫差异表达,为探究LBD转录因子在葡萄非生物胁迫中的作用奠定理论基础。【方法】根据已经报道的拟南芥LBD基因,利用葡萄基因组数据库中的BLAST软件鉴定葡萄基因组中的LBD基因。采用DNAMAN5.0、Clustalx、MapInspect、MEME、GSDS2.0、ExPASy和MEGA5.0等软件进行生物信息学分析。利用PLEXdb中葡萄Affymetrix GeneChip 16K基因芯片数据绘制芯片表达谱。采用qRT-PCR方法检测VvLBD基因家族在逆境胁迫中的表达情况。【结果】从葡萄(Vitis vinifera L.)全基因组中鉴定得到30个LBD基因家族成员,可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,ClassⅠ分为5个亚族,分别是Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe,ClassⅡ分为2个亚族,分别是Ⅱa和Ⅱb。理化性质分析表明,VvLBD基因家族编码氨基酸数目介于127—386,理论等电点分布在4.77—9.28。定位分析发现,该基因家族的30个基因分布于葡萄19条染色体中的11条染色体上,其中第13染色体上分布最多,有7个基因。多序列比对和motif分析结果表明,VvLBD基因家族具有特定的3个保守结构域,分别是类锌指结构、亮氨酸拉链结构和甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸(GAS)结构。亚细胞定位分析表明,VvLBD基因家族主要在叶绿体、线粒体和细胞核中进行表达。VvLBD基因家族的二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主。VvLBD基因芯片表达谱分析发现,大部分基因在盐胁迫和PEG胁迫下表达量上升,并且胁迫时间的长短对该基因家族成员的表达也存在差异。qRT-PCR分析结果表明,VvLBD基因家族成员中VvLBD8、VvLBD11、VvLBD12、VvLBD15、VvLBD16、VvLBD17在400 mmol·L-1 NaCl处理条件下呈上调表达,表达量分别是对照的3、1、8、4、5和13倍,VvLBD12和VvLBD19在10%PEG处理条件下呈上调表达,表达量分别是对照的4和26倍。【结论】从葡萄基因组中一共鉴定出30个LBD基因家族成员,分布于11条染色体上,并且结构进化高度保守;所有成员都与逆境相关,但是该基因家族成员在不同逆境胁迫下的响应程度存在一定的差异。

[目的]筛选单叶蔷薇bZIP转录因子家族的成员,并研究其结构特点、共线性以及在不同器官中的表达模式,为进一步揭示该家族在单叶蔷薇生长发育及抗逆响应中的作用奠定基础。[方法]以采自新疆的单叶蔷薇叶片为试验材料,采用生物信息学方法,对单叶蔷薇全基因组和转录组信息进行分析,包括理化性质、系统发育、基因结构、保守结构域、染色体位置、共线性和启动子分析,以及在根、茎、叶、花、果实中的表达模式。[结果]单叶蔷薇全基因组中共鉴定出50个单叶蔷薇bZIP转录因子家族成员,其蛋白质长度为149～700个氨基酸,分子质量为17.14～75.47 ku,等电点4.42～10.72,其中49个成员位于细胞核上。根据拟南芥bZIP转录因子家族的分类,将单叶蔷薇bZIP转录因子家族分为12亚族(A-K和S亚族),其中包括1对串联重复和7对片段重复;单叶蔷薇bZIP多含有1～15个与非生物胁迫有关的顺式作用元件。单叶蔷薇bZIP转录因子家族基因在不同器官中均有表达,各成员的表达量存在差异,其中Rbe013649在花中特异性表达,Rbe006639、Rbe028637在根中特异性表达,Rbe004215、Rbe028400、Rbe002636、Rbe002635在果实中特异性表达,Rbe011331在叶片中特异性表达。[结论]单叶蔷薇bZIP转录因子家族基因可能广泛参与各器官生长发育,其中Rbe013649可能调控花青素的合成,Rbe006639可能在抗旱过程中起重要作用。

NLP转录因子是植物特有的一类转录因子家族,在植物氮素吸收、转运和同化过程中发挥重要作用。为了解NLP基因在藜麦中的全基因组特征和表达模式,利用生物信息学方法在藜麦基因组中鉴定出9个藜麦NLP基因家族成员,并对其理化性质、染色体定位、基因结构、蛋白保守结构域、保守基序、系统进化以及在不同氮素水平处理下的表达模式进行了分析。结果表明,藜麦9个NLP基因分布于7条染色体上;每个成员含有4～5个外显子、3～4个内含子以及上游非翻译区;启动子中包含有大量激素和胁迫响应的顺式作用元件,其中,在CqNLP3和CqNLP4的启动子区域均预测到1个氮素响应元件GCN4。藜麦NLP蛋白长718～952个氨基酸,分子质量为80.48～104.86 ku,等电点5.31～6.50;每个成员都含有RWP-RK和PB1共2个保守结构域,其在蛋白中的位置具有很高的相似性,保守基序的分析进一步证实了这2个结构域的保守性。系统进化分析表明,9个藜麦NLP家族成员可分为ClassⅠ,ClassⅡ和ClassⅢ共3组,其在进化关系上与拟南芥的亲缘关系更近。在缺氮条件下,CqNLP2、CqNLP3、CqNLP5和CqNLP8表达受到抑制,低氮下则诱导表达;低氮处理后期,CqNLP9的表达量急剧增加。荧光定量PCR表达趋势与转录组数据一致。研究结果可为后续CqNLPs基因克隆和氮素胁迫分析提供参考依据。

[目的]筛选单叶蔷薇bZIP转录因子家族的成员,并研究其结构特点、共线性以及在不同器官中的表达模式,为进一步揭示该家族在单叶蔷薇生长发育及抗逆响应中的作用奠定基础。[方法]以采自新疆的单叶蔷薇叶片为试验材料,采用生物信息学方法,对单叶蔷薇全基因组和转录组信息进行分析,包括理化性质、系统发育、基因结构、保守结构域、染色体位置、共线性和启动子分析,以及在根、茎、叶、花、果实中的表达模式。[结果]单叶蔷薇全基因组中共鉴定出50个单叶蔷薇bZIP转录因子家族成员,其蛋白质长度为149～700个氨基酸,分子质量为17.14～75.47 ku,等电点4.42～10.72,其中49个成员位于细胞核上。根据拟南芥bZIP转录因子家族的分类,将单叶蔷薇bZIP转录因子家族分为12亚族(A-K和S亚族),其中包括1对串联重复和7对片段重复;单叶蔷薇bZIP多含有1～15个与非生物胁迫有关的顺式作用元件。单叶蔷薇bZIP转录因子家族基因在不同器官中均有表达,各成员的表达量存在差异,其中Rbe013649在花中特异性表达,Rbe006639、Rbe028637在根中特异性表达,Rbe004215、Rbe028400、Rbe002636、Rbe002635在果实中特异性表达,Rbe011331在叶片中特异性表达。[结论]单叶蔷薇bZIP转录因子家族基因可能广泛参与各器官生长发育,其中Rbe013649可能调控花青素的合成,Rbe006639可能在抗旱过程中起重要作用。

双子叶植物的木质素主要由愈创木基单体和紫丁香基木质素单体聚合形成,这两种单体的比例对造纸过程中木质素去除难易程度具有重要的影响。植物OMT基因家族的CCoAOMT和COMT基因是木质素合成途径的关键酶基因,可调控植物体内木质素单体的比例与含量。本文以所克隆的赤桉COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2三个基因的cDNA为模板,分别构建pET-32a的原核表达质粒,并优化在大肠杆菌BL21(λDE3)中的表达体系。结果显示,在加入0.4 mmol IPTG诱导表达后,COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2的原核表达质粒分别在4 h、2 h和3 h后达到可溶性重组蛋白表达峰值。通过渗透休...

【目的】探究水稻AP2/ERF转录因子在叶片衰老中的功能及其受miRNA和组蛋白修饰调控的转录机制。【方法】在全基因组水平对水稻(Oryza sativa)AP2/ERF家族成员及其上游靶向的miRNAs进行鉴定和生物信息学分析。对miRNA及其靶基因在水稻叶片衰老过程中的表达谱进行分析。通过RT-qPCR检测该家族成员及miRNAs在水稻叶片衰老过程中的互作关系。【结果】在水稻中共有155个AP2/ERF基因，所有成员启动子都含有光响应元件，大多数基因都具有茉莉酸(jasmonic acid, JA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)和厌氧诱导顺式作用元件。预测到45个miRNAs靶向调控水稻AP2/ERF家族的58个成员。鉴定出一系列在水稻叶片衰老过程中呈显著负相关的miRNA-靶基因对，暗示这些miRNAs可能通过抑制AP2/ERF基因的表达，参与水稻叶片衰老过程的调控。同时，发现4个AP2/ERF基因的表达量及其组蛋白H3K9ac富集水平随水稻叶片的衰老持续上升，说明这些基因表达同时受到H3K9ac修饰调控。【结论】在水稻叶片衰老过程中AP2/ERF基因的转录受其相应靶向的miRNAs和组蛋白H3K9ac修饰的影响。

【目的】从番茄全基因组中鉴定LBD基因,并进行基因进化、基因结构、染色体定位以及组织表达和诱导表达分析,为番茄LBD基因的功能研究与利用奠定基础。【方法】利用番茄基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定番茄LBD家族成员;采用MEGA5软件进行系统进化树分析;通过perl程序、MapDRAW及GSDS工具进行基因结构及染色体定位分析;利用已有的番茄芯片数据进行组织表达谱和基因表达响应分析。【结果】系统分析鉴定了46个番茄LBD家族基因,根据基因结构及系统进化分析将其分成class I与class II两类,细分为5个亚家族(Ia、Ib、Ic、Id与II)。基因定位表明,12条染色体中的10条均有...

【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。

【目的】研究LBD（Lateral organ boundaries domain） 基因家族在调控高粱干旱胁迫中的作用，为高粱（Sorghum bicolor）耐旱分子育种提供依据。【方法】利用生物信息学的方法鉴定高粱基因组中的LBD基因家族，对其理化性质、染色体分布、系统进化、基因结构、保守基序、顺式调控元件以及组织表达模式进行分析。【结果】鉴定出32个LBD基因，不均匀地分布在除6号染色体外的9条染色体上；系统发育树分析将其分为Class ?和Class II两组，均含有CX₂CX₆CX₃C结构域，其中Class ?有25个家族成员，含有相对完整的GAS和LX₆LX₃LX₇L结构域，Class II有7个家族成员，甘氨酸组成的保守序列均为GRA，LX₆LX₃LX₇L结构域不完整。同一组内的成员保守结构域蛋白序列一致性更高，基因结构和保守基序高度相似；系统进化分析发现高粱LBD蛋白与单子叶植物的同源性大于双子叶植物；顺式调控元件分析发现，SbLBD启动子序列中光响应元件G-box、脱落酸响应元件ABRE数量最多，其次是茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和厌氧诱导响应元件ARE，另外检测到低温响应元件LTR和干旱诱导元件MBS。表达分析发现，Class II中的7个成员和Class ?中的SbLBD24在高粱各生育期和多数组织中表达量均较高。在模拟干旱处理下，高粱幼苗中SbLBD6下调表达，SbLBD26上调表达。【结论】不同组SbLBD基因保守序列存在差异。高粱LBD家族基因可以响应低温、干旱、光强和光周期等多种逆境条件，且具有组织表达特异性。SbLBD6和SbLBD26可能在高粱干旱胁迫响应中具有重要作用。

【目的】YABBY转录因子家族仅存在于种子植物中，对植物的早期胚胎发育、果实发育、次生代谢物合成、逆境应答、侧生器官分化和背腹极性建立等方面均具有重要作用，而目前对鹅掌楸属植物的YABBY家族基因的研究较少。为了解北美鹅掌楸YABBY家族的成员和特征，对其成员进行了鉴定、亚细胞定位及表达模式分析等研究工作。【方法】从北美鹅掌楸花器官转录组中筛选出YABBY家族基因序列，采用RACE扩增技术获得了其中2个差异表达基因的全长，分别命名为LtYABBY1,5，并对他们进行生物信息学分析。随后，利用RT-qPCR检测LtYABBY1,5在北美鹅掌楸的根、茎、叶、花芽、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等8个组织中的表达水平。最后，通过烟草瞬时转化体系对LtYABBY1,5蛋白进行进一步亚细胞定位分析。【结果】在北美鹅掌楸中共鉴定出6个YABBY成员，分别属于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5亚族，外显子数量均为7个。克隆所得其中2个基因LtYABBY1,5，全长分别为1 255、1 078 bp，编码了210、188 aa，生物信息学分析结果显示，两者均为亲水蛋白与非跨膜蛋白。RT-qPCR试验发现LtYABBY1整体表达水平较高，尤其是在北美鹅掌楸的花芽和雌蕊中高表达，而LtYABBY5整体表达水平较低，仅在叶片、花芽、雌蕊和萼片中有少量表达。亚细胞定位分析结果表明，LtYABBY1,5蛋白定位于细胞核，与预测结果基本一致。【结论】北美鹅掌楸YABBY成员较少，其中LtYABBY1在花芽中特异表达，基于上述结果，推测该基因可能参与了北美鹅掌楸花芽的早期分生组织的发育调控。

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca~(2+)的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结论】整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。

茉莉花JsMYB108转录因子可以调控茉莉萜类合成酶基因JsTPS2的表达，是香气合成相关的转录因子.本试验将茉莉JsMYB108转录因子的编码序列利用酶切连接方法构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，转化大肠杆菌BL21(DE3)株系，设定了4个IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L~(-1))和3个诱导温度(20、28、37℃)用于筛选合适的蛋白诱导条件，在此基础上对诱导出来的蛋白进行分离纯化和检测.结果表明：4个IPTG浓度均可成功诱导出分子质量约为59 ku的融合蛋白，不同IPTG浓度间诱导表达的蛋白量无显著差异；20、28、37℃均可诱导出融合蛋白，但相比28、37℃的诱导温度，20℃过夜诱导表达下的可溶性蛋白含量最高，更有利于重组蛋白的纯化.后续用0.1 mmol·L~(-1) IPTG、20℃作为大量诱导JsMYB108融合蛋白的条件，利用GST亲和树脂分离纯化了融合蛋白，并通过Western blotting对纯化的蛋白进行了验证.研究结果可为后期筛选JsMYB108互作蛋白及其蛋白功能的研究提供参考.

【目的】对来航鸡ＦＯＸＬ２基因进行真核表达及纯化，为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的来航鸡ＦＯＸＬ２基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＦ＿７０８８６８．１）设计引物，以来航鸡全血Ｄｎａ为模板，ＰＣＲ扩增ＦＯＸＬ２基因，经ｅＣＯＲⅠ和ＸＢａⅠ双酶切后定向克隆于ＰＰＩＣＺαａ中，获得ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体。将ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２转化毕赤酵母菌ＧＳ１１５，用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行ＳＤＳ－ＰａＧｅ和ＷｅＳｔｅＲｎ ＢＬＯｔｔＩｎＧ检测。【结果】克隆了９１８ＢＰ的ＦＯＸＬ２基因；成功构建了ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体；实现了ＦＯＸＬ２．．．