为探讨KK-42显著缩短日本沼虾(Macrobrachium nipponense)蜕皮周期的可能机制,本研究采用RACE技术首次从头胸甲中获得了一个含几丁质结合-4(chitin_bind_4)结构域的表皮蛋白(cuticle proteins,CPs)c DNA基因全长,命名为Mn CP-1。该序列全长604 bp,可编码122个氨基酸。氨基酸序列比对显示,Mn CP-1与普通黄道蟹(Cancer pagurus,P81576.1)相似性最高(61%)。系统进化分析发现,Mn CP-1与地中海实蝇(Ceratitis capitata)聚类为一支。Real-time PCR结果显示,头胸甲中Mn CP-1在蜕皮前期晚期(D3-4期)和蜕皮后期(A期)的表达量较高,而在蜕皮间期(C期)和蜕皮前期早期(D0-2期)的表达量较低。KK-42处理能显著上调C期和D0-2期Mn CP-1的表达,在处理后6、24和48 h,其mRNA表达水平较对照组高3倍以上。结果表明,头胸甲上皮细胞Mn CP-1的表达与蜕皮周期有关,KK-42可显著上调C期和D0-2期Mn CP-1的表达。

为探讨KK-42提高感染嗜水气单孢菌的日本沼虾幼虾成活率的机制,实验首次克隆了α2M部分序列,研究了α2M基因的时空表达以及KK-42对其表达和活力的影响。将体长3.5~5.0 cm的日本沼虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,12 h后,每组再分为2个亚组,分别向虾腹部注射嗜水气单胞菌菌悬液(菌攻毒实验组和菌攻毒对照组)或生理盐水(实验组-1和对照组-1),于不同时间点测定幼虾的成活率、α2M基因表达水平和活力的变化。结果显示,KK-42预处理可显著提高感染嗜水气单胞菌的日本沼虾幼虾成活率。经BLAST比对,克隆的α2...

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-4...

为探讨咪唑类物质KK-42可能的作用机制,首次克隆了热激蛋白90(HSP90)部分mRNA序列,研究了HSP90以及HSP70基因的时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5～5.0cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1min,之后在相同条件下常规饲养。结果显示,HSP90和HSP70在凡纳滨对虾大颚器官、眼柄、肌肉和肝胰腺都有表达,其中,肝胰腺中的表达水平较高。实验期间,肝胰腺中两种HSPmRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低;KK-42处理可显著诱导肝胰腺HSP的表达,在处理后第1、2、3天,HSP70和...

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库获得内表皮蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因Lm Abd-5的c DNA序列,分析该基因的序列特征和m RNA表达特性,采用RNAi方法分析其生物学功能,探讨其在飞蝗表皮形成中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库,获得Lm Abd-5 c DNA全长序列并克隆验证;采用Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,利用SMART网站预测其功能域,使用

为了探索ＫＫ－４２对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能的机制，以水产基地自行繁殖的２月龄幼虾（体长１．２～２．０ ｃｍ）为材料，捕捞后暂养于流水养殖水槽，水温（２６±１）°ｃ，每天投喂２次，１周后用于实验研究。用１．９５×１０–４ ｍｏｌ／ｌ的ＫＫ－４２溶液（处理组）或不含ＫＫ－４２溶液（对照组）浸润１ ｍｉｎ，取出，一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定；从剩余部分中选择处于蜕皮间期（ｃ）和蜕皮前期（Ｄ）的幼虾，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ分析表皮几丁质酶１基因（ｍｎｃｈｉ－１）的转录水平，同时进行表皮几丁质酶的活力测定。在实验观察期间，ＫＫ－４２处理组平均体质量均显著高于对照组，体质量增长率．．．

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）是苜蓿田的重要害虫，严重影响苜蓿的产量和品质。为解析豌豆蚜适应苜蓿的分子机制，本研究检测豌豆蚜取食“猎人河”（感蚜）和“甘农5号”（抗蚜）2个苜蓿品种后6个表皮蛋白基因（ApCP7、ApCP10、ApCP19、ApCP35、ApCP62和ApCP19.8-like）的表达水平，并检测了沉默了2个表皮蛋白基因（ApCP7和ApCP62）的豌豆蚜在“猎人河”苜蓿上的存活率。结果表明，与取食“猎人河”苜蓿相比，取食“甘农5号”苜蓿后，豌豆蚜6个表皮蛋白基因的表达水平在头部中显著下调（P<0.01），而在卵巢显著上调（P<0.01）。在腹部组织中，除表皮蛋白ApCP7基因显著上调（P<0.01）外，其余表达水平均显著下调（P<0.01）；ApCP7、ApCP19、ApCP19.8-like和ApCP62在表皮组织中显著上调（P<0.05）。沉默表皮蛋白基因ApCP7和ApCP62后，豌豆蚜取食“猎人河”苜蓿72h后的存活率均显著降低（P＜0.05），分别为76.67%±0.37%和80.67%±0.58%。据此推测，ApCP7和ApCP62可能在豌豆蚜适应不同抗性水平的苜蓿品种中发挥作用，结果可为解析豌豆蚜与苜蓿的互作关系提供理论依据。

为进一步探究KK-42缩短蜕皮周期的分子机制,本研究以日本沼虾幼虾为材料,通过RACE技术克隆了几丁质降解途径中的限速酶NAGase基因全长cDNA序列,定量测定了KK-42处理不同时间对表皮组织中NAGase mRNA相对表达量和酶活力的影响。序列分析结果显示,MnNAGase cDNA全长2536 bp,编码617个氨基酸。同源性分析显示,MnNAGase基因保守性较低,与凡纳滨对虾的相似度最高,仅为68%。系统进化分析显示,日本沼虾、三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾聚为一个大类,凡纳滨对虾和中国明

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库搜索并克隆获得飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1(nymph cuticle protein 1),分析其序列特征和表达特性,通过蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导和干扰20E受体基因LmEcR表达研究其表达调控,并基于RNA干扰(RNAi)方法分析其生物学功能,为阐明该基因在飞蝗表皮发育过程中的作用提供理论依据。【方法】依据飞蝗转录组数据库获得表皮蛋白基因LmNCP1,结合RT-PCR技术克隆获得其全长开放阅读框(O

【目的】探讨家蚕(Bombyx mori)表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及与几丁质的结合方式,为家蚕表皮蛋白的功能研究提供依据。【方法】应用生物信息学方法分析家蚕CPAP家族表皮蛋白及BmCPAP3-G的结构域的序列特征;利用原核表达的方法表达BmCPAP3-G的融合蛋白,通过镍柱亲和层析技术纯化可溶性蛋白,利用5800 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定正确后进行多克隆抗体制备,并利用几丁质亲和层析技术验证BmCPAP3-G与几丁质的结合;利用半定量RT-PCR和Western blot方法对Bm

为探讨动植物蛋白对日本沼虾生长、肌肉组成、抗氧化、TOR信号通路及食欲调节相关基因表达的影响，实验配制了3组等氮等能饲料，分别为鱼粉组(FM)、混合植物蛋白组(豆粕，菜粕，玉米蛋白粉)(PPB)和混合植物蛋白添加氨基酸组(PPB/Aa)，投喂饲养日本沼虾8周。结果发现，PPB和PPB/Aa组日本沼虾增重率和摄食率显著低于FM组，而饲料系数显著高于FM组，各组之间成活率和肌肉必需氨基酸组成无显著差异；FM组肝胰腺丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著低于PPB组和PPB/Aa组，各组谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)无显著差异，PPB与PPB/Aa组血清碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和ALT的活性均显著高于FM组；与FM组相比，PPB与PPB/Aa组显著降低了雷帕霉素靶蛋白(TOR)、核糖体蛋白S6激酶(S6K)及神经肽(NPY)基因的表达，但各组瘦素(leptin)基因的表达无显著差异。研究表明，鱼粉与混合植物蛋白对日本沼虾肌肉中氨基酸组成无显著影响，但混合植物蛋白源降低了虾的生长和抗氧化能力及TOR信号通路与NPY基因表达，且添加氨基酸不能缓解混合植物蛋白所引起的生长抑制、氧化应激及蛋白质合成和食欲相关基因表达的降低。

为了深入探究KK-42对表皮结构的影响,本实验以外表皮形成趋于结束而内表皮开始出现的蜕皮后期幼虾为材料,通过扫描电镜观察石蜡切片法,分析了KK-42处理前后头胸甲外表皮,尤其是内表皮结构的变化。将处于蜕皮间期的健康幼虾[体长(3.5±0.1)cm]随机分为2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液处理,取蜕皮后1.5、3.0、6.0及12.0 h幼虾头胸甲,观察其超微结构。另取蜕皮后6.0 h头胸甲,用解剖刀轻轻刮去内面组织,通过扫描电镜观察内表皮的表面结构。结果显示,蜕皮后1.5和3.0 h,头胸甲只包含上表皮和外表皮,KK-42处理组外表皮的板层数量显著增加,外表皮厚度分别比相应对照组提高了72.07%和38.67%;蜕皮后6.0～12.0 h,外表皮中疏松的板层趋于致密,其厚度在二组间无统计学差异。蜕皮后6.0 h,只有1层板层的内表皮出现,到蜕皮后12.0 h,板层数增至2层(对照组)和3层(处理组),且板层结构均疏松。此外,内表皮表面分布着大小不等、头尾走向的梭形孔道(pore canals);KK-42处理组内表皮结构未见明显变化。实验表明,KK-42对蜕皮后期日本沼虾幼虾头胸甲的超微结构有显著影响,能加快外表皮及内表皮板层的形成速率。

为了解日本沼虾几丁质合成酶(Chs)基因在蜕皮过程中的作用,本实验采用RACE技术首次从表皮中克隆了几丁质合成酶基因(Mn Chs)c DNA全长,并用生物软件对其序列进行生物信息学分析,RT-PCR技术检测该基因的时空表达模式。结果表明,其c DNA全长5 133bp,5'UTR为283 bp,3'UTR为159 bp,开放阅读框(ORF)长度为4 701 bp,编码1 566个氨基酸,分子量为179.57 ku,理论等电点为6.09,包含2个几丁质合成酶的标签序列EDR和QRRRW及Chitin-synth-C结构域。经BLAST比对,与日本仿长额虾、淡水枝角水蚤Chs相似性分别为89%和...

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)是一种能够可逆结合并抑制半胱氨酸蛋白酶类的活性的蛋白,为了明确日本沼虾(Macrobrachium nipponense)CST基因(Mn CST)序列及其在日本沼虾卵巢中的作用,本研究利用RACE方法克隆获得日本沼虾Mn CST全长cDNA序列,利用qRT-PCR分析了其在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达情况,并利用RNA干扰(RNAi)技术初步分析了Mn CST在日本沼虾卵巢发育中的作用。结果显示,Mn CST cDNA序列全长6199 bp,包含1183 bp 5′非编码区、2304 bp 3′非编码区和2709 bp开放阅读框,编码903个氨基酸残基,其氨基酸序列上有6个cystatin-like(半胱氨酸蛋白酶抑制因子样)结构域和42个磷酸化位点;Mn CST基因在各个组织中均有表达,肠中表达量最高;日本沼虾不同发育阶段的卵巢中均有Mn CST基因表达,Ⅳ期卵巢中表达量最高,Ⅱ期卵巢中表达量最低;Mn CST基因在日本沼虾卵巢中的表达变化与组织蛋白酶B(Cts B)和组织蛋白酶L(Cts L)基因的表达变化基本是一致的,但对卵黄蛋白原(Vg)基因的表达没有直接影响。Mn CST在日本沼虾卵巢中的作用可能主要是抑制Cts B和Cts L的活性,在日本沼虾卵巢发育过程中对Vg的水解起间接的调控作用。

【目的】分析飞蝗(Locusta migratoria)内表皮结构糖蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因LmAbd-2的序列特征和表达特性,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术结合Hematoxylin and eosin(H&E)染色方法以及透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)技术探究其生物学功能,探讨其对飞蝗内表皮发育的影响。【方法】基于课题组飞蝗转录组数据库获得LmAbd-2的cDNA编码序列,并克隆验证。利用ExPASy工具翻译LmAbd-2氨基酸序列,然后利用SignaIP4.1Server和SMART软件分别对其信号肽和结构域进行分析;利用NetOGlyc4.0 Server对其糖基化位点进行预测,使用GENEDOC软件进行多序列比对,并利用MEGA 6.0软件中neighbor-joining(NJ)方法与其他昆虫同源序列进行聚类分析。采用荧光定量PCR(reverse-transcription quantitative PCR,RT-qPCR)分析LmAbd-2在飞蝗5龄第2天不同组织以及4龄(N4D1—N4D6)、5龄(N5D1—N5D8)和成虫(AD1—AD4)表皮不同发育时期表达模式。采用RNAi技术结合H&E染色方法以及TEM技术观察干扰LmAbd-2后对飞蝗生长发育和表皮结构的影响。【结果】序列分析结果显示,飞蝗LmAbd-2 cDNA编码序列长为683 bp,开放阅读框为459 bp,编码152个氨基酸;功能域分析发现LmAbd-2含有1个信号肽和1个几丁质结合域(chitin binding domain 4,ChtBD4),属于CPR家族RR-1亚类;序列比对分析发现其在物种间具有较高的保守性,其中与沙漠蝗(Schistocerca gregaria)SgAbd-2序列相似度为92.5%,且在N末端含有一个保守基序PTPPPIP,其中第2位苏氨酸为糖基化位点;系统发育分析结果显示LmAbd-2与SgAbd-2聚为一支,亲缘关系最近;RT-qPCR分析结果显示LmAbd-2在体壁中高表达,且在蜕皮后(内表皮形成时期)高表达;沉默LmAbd-2后飞蝗没有肉眼可见的表型,但H&E染色结果显示与对照组相比飞蝗表皮层变薄,进一步超微结构分析发现内表皮片层结构减少。【结论】LmAbd-2是一种内表皮结构糖蛋白,属于CPR家族RR-1亚类,其编码基因主要在体壁中高表达,而且在飞蝗4龄、5龄和成虫内表皮形成时期呈周期性表达;RNAi试验表明,LmAbd-2在飞蝗蜕皮过程中参与内表皮的形成。