研究根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列设计了两条引物,通过RT-PCR技术对IBDV的VP2进行扩增,构建IBDV-VP2的标准品质粒,建立基于IBDV-VP2基因的荧光定量RT-PCR检测(QRT-PCR)技术和标准曲线,并检测该QRT-PCR体系的特异性、灵敏度和重复性,最后将该QRT-PCR体系应用于鸡外周血淋巴细胞(PBLs)中IBDV超强毒株(vvIBDV)复制规律以及临床样品的检测。结果表明,建立的QRT-PCR体系特异性好,不能与NDV、IBV及FAV1等发生反应,敏感度为1.51×101拷贝数/μl,扩增效率达1.018,重复性试验组内变异系数和组间变异系数均小于...

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPLmRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPLcDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPLmRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(R2=0.9...

根据hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA序列,设计并合成3对引物,将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,体外转录出RNA,系列稀释作为阳性标准品,用于标准曲线的绘制和样品检测,并用持家蛋白GAPDH基因对样品进行归一化,建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测。结果证明,建立的一步法荧光定量RT-PCR技术可以真实地反映反应管中模板的数量,可用于猪hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA水平的检测。

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜(Toxoptera citricida)中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104....

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法,从分子水平研究脑心肌炎病毒(EMCV)的致病机制,分别构建含有猪促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品,建立了检测IL-1β/β-actin、IL-6/β-actin、TNF-α/β-actin的多重TaqMan real-time PCR检测方法。标准曲线的相关系数均达到0.998以上;初始模板的检出下限均达到10拷贝/μL;只有以目标cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才能检测到荧光信号;组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感...

青蟹呼肠孤病毒 (mud crab reovirus，MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一，青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播，本研究研发了一种筛选无MCRV种蟹的荧光定量检测方法。为最大限度提高检测灵敏性，本研究首先分析了MCRV在感染青蟹主要组织中的含量，发现血淋巴中病毒载量最高；随后分析该病毒的13个预测基因在血淋巴中的表达水平，发现病毒VP11基因相对表达量最高；最后基于VP11基因序列保守区设计特异引物，建立了一种SYBR Green qRT-PCR (quantitative reverse-transcription PCR)检测方法，该方法可精确检测病毒下限为50 copies/反应。考虑到该检测方法还具有组织和靶标基因选择优势，其灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法。使用该方法对含有5种常见甲壳动物病原的样品进行检测，均无特异性扩增。抽取微量血淋巴(大约50 μL/只)提取RNA，随后使用该检测方法对22只种蟹和20只市售青蟹进行MCRV检测，阳性率分别54.55%和85.00%。此外，利用该方法进一步分析了MCRV在较低温度下(21℃)在青蟹体内增殖情况，发现病毒感染早期呈指数方式增殖，随后进入平台期，实验周期内无青蟹死亡。总之，本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的MCRV检测方法，其既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选，也能满足病原感染相关研究的需要。

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对...

【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）野毒株、猪A群轮状病毒（GARV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪阿尔法冠状病毒（SADS-CoV）及猪捷申病毒（PTV）5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析，以PEDV野毒株为模板，对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针，并在两端保守区域设计上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针，并加入简并碱基。同时，分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化；用RStudio参照代码绘制ROC曲线，确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC，并计算Youden指数，最终确定检测临界值；从阳性核酸中扩增靶基因，并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录，获得5种标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估；并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为：35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL，标准曲线线性关系良好，扩增效率在96.3%—104%之间；该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、大肠杆菌（E.coli）、猪链球菌（S.suis）和葡萄球菌（S.aureus）等多种菌毒株均不检出，具有良好的特异性；经重复性检验，组内变异系数在0.22%—3.08%之间，组间变异系数在0.89%—4.0%之间；对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较，符合率分别为：PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外，对临床样本检测结果显示，当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行，其总体阳性率分别达到：10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242)，且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染，使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究，为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR，为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。

【目的】猪Ｄｅｌｔａ冠状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＰＤｃｏｖ）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中ＰＤｃｏｖ的感染情况。【方法】通过对Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中ＰＤｃｏｖ全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０在线软件设计１对扩增ＰＤｃｏｖ核衣壳（ｎ）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克．．．

利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片

为进一步研究甘薯病原微生物的侵染对甘薯病程相关非表达子1基因(NPR1)表达的影响,以甘薯肌动蛋白(β-ac-tin)基因为内参照基因,提取甘薯叶片总RNA,反转录为cDNA,同批异管对该2个基因进行PCR扩增.通过对循环数的优化和对体系重复性、准确性的分析,建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系.

根据Gen Bank上的基因序列,在保守区设定并合成特异性引物,选择β–actin作为内参基因,采用SYBR Green I染料法,进行熔解曲线分析和标准曲线的制作。熔解曲线表明,β–actin、IL–1β、IL–8的基因产物均为特异性产物,其Tm值分别为86、82.5和84℃;标准曲线表明,各基因Ct值的检测范围为12~32,扩增效率分别为96.3%,103.2%和102.6%,具有良好的线性关系,且r2均大于0.990;组内变异系数分别为0.14%~0.86%,0.18%~0.93%和0.13%~0.86%;用建立的方法检测健康建鲤头、肾组织中IL–1β、IL–8的表达情况,相对表达量分别...

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...

罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测Mr...