以H5N1亚型禽流感病毒接种鸡胚 ,收取鸡胚液为抗原研制了禽流感灭活疫苗 ,并对制苗抗原以及疫苗的物理性状、安全性、免疫效力、免疫剂量和保护期等进行了试验。结果表明 ,获得了较高效价的制苗抗原 ,灭活前后HA分别为 2 10 0～ 11 0 和 2 9 0～ 10 0 。试制疫苗物理性状符合要求 ,安全性良好。试验鸡在免疫 14d后血清抗体达到2 7 5,2 10d血清HI抗体仍维持在 2 5 0 左右 ;免疫后 18d使用高致病性H5亚型禽流感病毒攻毒 ,获得 10 0 %的保护。分别使用 0 1,0 3和 0 5mL免疫鸡 ,发现 0 3～ 0 5mL剂量组免疫后血清抗体达到...

对主要用于我国高致病性禽流感防控的重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的种类和使用情况,以及国内高致病禽流感流行株的主要分支情况作一介绍。随着病毒抗原性的不断变异,疫苗毒株也需随之进行更换,因此必须使用匹配相应分支的疫苗才能取得理想的防控效果。目前国内重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的生产现状是共有10家生产企业,其中2个厂家采用悬浮细胞工艺生产,其余8个厂家均采用鸡胚工艺进行疫苗生产。笔者根据企业上报的产品批签发报告情况,以2016年至2017年农业部规定的高致病性禽流感强制免疫疫苗重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)为例,着重从疫苗的安全性和效力两方面对4家重组禽流感灭活疫苗生产企业共计488批次产品的批签发检验数据进行了质量分析。从Re-6株、Re-7株、Re-8株不同组分效价的比较可以看出,所有批次疫苗抗体效价几何平均滴度(GMT)至少高于国家标准1个滴度以上,而Re-6株和Re-8株组分抗体效价(GMT)高于国家标准2个滴度以上。虽然产品的效价都超过了国家标准,但抗体水平还是参差不齐,较高产品的3个组分抗体效价(GMT)比较低的要高出1.5个滴度以上。各生产企业产品批间差异较大,这虽有生产工艺不断成熟和优化的因素,但对于相近批次产品批间差异出现较大差异,则说明企业生产工艺并不十分稳定。4个企业在2017年生产的疫苗各组分抗体效价GMT整体水平均比2016年有所提高,说明生产工艺的不断成熟和优化,企业对产品质量的进一步严格把关。我国禽流感病毒灭活疫苗含有的甲醛和细菌内毒素是造成疫苗副反应的直接原因,因此通过生产工艺改进,降低疫苗中甲醛和细菌内毒素的含量,可以降低疫苗的副反应。核酸疫苗是当前禽流感疫苗研究发展的前沿技术,是现阶段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗,也是禽流感疫苗研究的一大热点。另外,具有交叉保护性的广谱免疫原性的通用疫苗可以有效的解决抗原漂移这一难题,是现阶段流感疫苗研究的一个重要研究方向。

【目的】我国批准使用的H9亚型禽流感（avian influenza,AI）商品化灭活疫苗种类繁多，其免疫效果和选用受到养殖者的广泛关注。通过评估不同商品疫苗对我国近期H9N2亚型AIV的免疫保护效果，以期为H9亚型AIV的免疫防控提供科学参考。【方法】依据国家兽药基础数据库疫苗批签发数据，从在售的40种H9亚型AI商品疫苗中选择批签发数量较多的4种疫苗（A—D疫苗），进行免疫攻毒试验。4株h9.4.2.5分支的H9N2亚型分离株CK/XJ/S1204/2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/S4590/2020为攻毒毒株，分别测定4株病毒的鸡胚半数感染量（EID_(50)）、鸡半数感染量（CID_(50)）和细胞半数感染量（TCID_(50)），以确定动物试验的攻毒剂量和细胞试验的感染剂量。每种疫苗以产品推荐剂量免疫3周龄SPF鸡各40只，同时设同日龄SPF鸡40只接种PBS作为对照组；免疫3周时，采集所有试验鸡血清，测定血凝抑制抗体（HI）和中和抗体（NT）滴度；同时将每种商品疫苗接种40只SPF鸡进行随机分组，每组10只，连同10只对照组鸡，以10 CID_(50)的剂量鼻腔感染H9N2亚型分离株，分别进行商品疫苗对4株病毒的攻毒保护试验。采集攻毒后3、5 d喉头及泄殖腔棉拭子样品，接种10日龄鸡胚检测排毒情况，统计疫苗保护率，比较疫苗对H9N2亚型分离株的免疫保护效果。【结果】4株H9N2亚型分离株的CID_(50)依次为10~(3.5)、10~(2.5)、10~(2.5)和10~(3.5) EID_(50)/0.1 mL。商品疫苗接种后3周，各免疫组SPF鸡血清中针对商品化H9亚型HI试验抗原（CK/SH/10/2001）的HI抗体均在9.4 log_2—11 log_2之间，但针对攻毒株的HI抗体平均效价在4.6 log_2—10.8 log_2之间，不同疫苗免疫组间存在较大差异，最大差异为64倍，各免疫组NT抗体平均效价在6.7 log_2—12.2 log_2之间，最大差异为32倍，对照组鸡的HI抗体和NT抗体均为阴性。以滴鼻方式感染不同H9病毒后，4种疫苗的免疫保护效果存在较大差别，在攻击CK/XJ/S1204/2015毒株的试验中，3种疫苗（B—D疫苗）能为免疫鸡提供80%以上保护；在攻击DK/JX/S4512/2017毒株试验中，仅1种疫苗（B疫苗）能为免疫鸡提供80%以上保护；在攻击CK/YN/S1666/2020毒株的试验中，2种疫苗（A和B疫苗）能为免疫鸡提供80%以上免疫保护；而攻击CK/NX/S4590/2020毒株，4种疫苗免疫鸡的保护率均低于80%，而同期各对照组鸡均排毒，排毒率均高于80%。【结论】不同商品疫苗预防近期H9亚型分离株感染的免疫保护效果存在较大差异，疫苗抗原与分离株之间的抗原性差异是免疫保护率降低的主要原因；使用H9N2亚型流行毒株测定免疫后的HI抗体和NT抗体可作为评价商品疫苗免疫保护效果的重要依据。本研究为商品H9疫苗的科学选用提供重要参考。

本试验利用蔷薇科植物提取物(SHY)分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用。结果表明:SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活(6/8),病毒分离阳性。在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5...

【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气...

【目的】将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(AIVHA)基因转入牧草植物中,利用豆科牧草作为植物生物反应器来生产禽流感抗原蛋白,探索研制禽流感转基因植物可饲用疫苗的可行性。【方法】以百脉根子叶柄外植体作为转化受体,通过农杆菌介导法将AIVHA基因导入百脉根,子叶柄外植体经过共培养、筛选分化、再生,得到抗性植株。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR检测和Western blot分析。【结果】证明AIVHA基因已经导入到百脉根基因组中,在核酸水平和蛋白水平都得到了表达。【结论】利用百脉根表达禽流感抗原蛋白是可行的。

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡:6 050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,50只,同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组100只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10~6 cells/mL左右增殖到1.0×10~7 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512,TCID_(50) 10~(7.67)/mL,EID_(50) 10~(7.83)/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256,TCID_(50)达10~(7.33)/mL,EID_(50)10~(7.17)/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024,TCID_(50) 10~(8.5)/mL,EID_(50) 10~(8.38)/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416,二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776,6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137,42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。

【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52kD,具有免疫学活性。在25min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和N...

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒南京毒株（ＮＥ４）在鸭胚中增殖后，用甲醛灭活，加入７号白油，制成ＥＤＳ油佐剂灭活疫苗，抗原量为每头份５０００血凝（ＨＡ）单位。经１２００万只鸡的试用表明，该苗能够有效地预防ＥＤＳ的发生。

以马链球菌兽疫亚种 (Stretococcusequisubsp zooepidemicus)ATCC35 2 4 6株和猪链球菌 2型 (S suistype 2 )HA980 1株作为生产菌株 ,制备氢氧化铝胶二联灭活疫苗。经过无菌及安全检验合格 ,肌肉接种仔猪 ,每头 2mL。免疫15d后 ,对HA980 1和ATCC35 2 4 6的保护率分别为 10 0 % (2 6 / 2 6 )和 92 3% (2 4 / 2 6 )。用二联灭活苗免疫后 4周内仔猪体内抗体水平持续上升 ,从第 5周开始逐渐下降 ;再次免疫后 ,抗体水平迅速回升 ,12 0d后仍维持较高水平。攻毒保护试验和抗体...

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因。熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(79.5±0.3)℃和(83.3±0.3)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150 bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列。该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰。AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA无扩...

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染成功拯救了该病毒(R-GSGD/1/96)。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性,即对鸡都是高致病性毒株,R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10;救获病毒与野生病毒一样,尽管10...