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[期刊] 草业科学
[作者]
朱爱文 刘海霞 德庆卓嘎 韩大勇 格桑加措 闫伟 平措班旦 朱戈辉
热休克蛋白A2 (HSPA2)是热休克蛋白HSP70家族重要成员，能够促进睾丸支持细胞增殖；精子发生相关基因6 (SPATA6)能够调控肌球蛋白合成的微丝运输系统，影响精子细胞骨架形成。在雄性哺乳动物生殖过程中，两者均起重要作用。为研究HSPA2和SPATA6在雄性彭波半细毛羊生殖过程中的表达规律和细胞定位，以不同年龄阶段(3月龄、12月龄和3岁龄)彭波半细毛羊睾丸组织为研究对象，运用实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR,qRT-PCR)、Western blot和免疫组织化学染色法(IHC)从转录和翻译水平检测了HSPA2和SPATA6在不同年龄阶段彭波半细毛羊睾丸组织的表达水平和分布模式，分析预测HSPA2和SPATA6在彭波半细毛羊睾丸发育和精子发生过程中的调控作用。结果表明：12月龄和3岁龄彭波半细毛羊睾丸组织中HSPA2 mRNA的相对表达量以及蛋白表达量极显著高于3月龄(P <0.01);12月龄SPATA6 mRNA的相对表达量以及蛋白表达量极显著高于3月龄(P <0.01)，显著高于3岁龄(P <0.05)。不同年龄阶段彭波半细毛羊睾丸组织的支持细胞和间质细胞中HSPA2和SPATA6蛋白均有分布。初步推断，HSPA2和SPATA6的表达水平变化在调控彭波半细毛羊精子发生过程和促进精子成熟中具有重要作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
温泽星 余四九 翟羽佳 杨琨 刘鹏刚 何俊峰 崔燕
【目的】探索热休克蛋白70-2(heat shock 70kD protein-2,HSPA2)在牦牛不同组织器官中的表达差异。【方法】选取3头1岁龄的健康青海高原雄性牦牛为研究对象,在正常生理条件下,于2013年9月中旬采集不同组织器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和睾丸)样本。(1)从牦牛不同组织器官中提取RNA,将RNA反转录成第一链cDNA,参照牦牛HSPA2和β-actin基因序列(登录号为KC790105.1和DQ838049.1)设计特异性引物,首先采用RT-PCR来验证实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是否能应用于牦牛不同组织器官中HSPA2表达差异的测定;然后采用RT-...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张梦瑶 杨峰 刘开东 刘积凤 柳楠 贺建宁 薛明
旨在构建敖汉细毛羊BMP4基因的质粒及转染成纤维细胞后研究基因表达量的变化。以30日龄的敖汉细毛羊胚胎为研究对象。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中BMP4基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得BMP4基因片段、将得到的BMP4基因连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-BMP4重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将重组pcDNA3.1-BMP4表达载体转染成纤维细胞,后检测BMP4基因在mRNA和蛋白水平上表达量的变化。结果显示:pcDNA3.1-BMP4构建成功后转染成纤维细胞BMP4基因的mRNA和蛋白表达量均显著上升,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P<0.01)。成功构建了敖汉细毛羊BMP4基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张元鹏 杨占娜 杨利 李兰 于晓明 杜露平 陈瑾 侯立婷 乔绪稳 侯继波 郑其升
[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
姚毅 雷承志 尹君亮 刘福元 陈玉林
选取60只新疆细毛羊和48只陕北细毛羊,利用PCR-SSCP分子标记对其羊毛细度候选基因的5个位点(S1,S2,S3,S4,S5)进行了多态性分析。结果表明,2个绵羊品种在5个位点上A等位基因的频率均高于B等位基因。在S1,S5位点上,新疆细毛羊和陕北细毛羊均检测到AA,AB,BB 3种基因型;在S2位点上,新疆细毛羊检测到AA,BB,CC,DD 4种基因型,陕北细毛羊检测到AA,AB,BB 3种基因型;在S3位点上,新疆细毛羊检测到AA,AB 2种基因型,陕北细毛羊检测到AA,AB,BB 3种基因型;在S4位点上,新疆细毛羊和陕北细毛羊均检测到AA,BB 2种基因型。新疆细毛羊和陕北细毛羊的...
关键词：
细毛羊 羊毛细度 PCR-SSCP
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张国升 左敬 甘瑞 朱峰伟 孙燕 王鲜忠 张家骅
【目的】确定FSH和雌激素联合作用是否可通过ERK1/2级联调节培养条件下未成熟仔猪睾丸支持细胞中Skp2的表达。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用Western blotting和实时荧光定量PCR检测Skp2蛋白、mRNA的表达。【结果】FSH(50 ng.mL-1)和17β-雌二醇(10-9 mol.L-1)联合作用时以时间依赖的方式促进了Skp2蛋白和mRNA的表达(P
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李雨谦 敬科民 张鹏 田园 董文静 张明 钟金城 蔡欣
【目的】探究CDC25A基因在牦牛、犏牛睾丸组织和生精细胞中的表达差异及基因序列的异同。【方法】选取牦牛、犏牛为试验动物，通过实时荧光定量PCR技术分别检测CDC25A基因在牦牛、犏牛睾丸组织和生精细胞的表达量，以牦牛、犏牛睾丸组织cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增克隆该基因，并通过生物信息学工具分析两者结构和功能的异同。【结果】经免疫荧光鉴定，生殖细胞标志蛋白（DDX4）在牦牛、犏牛悬浮细胞中有阳性表达，表示该细胞群为生殖细胞。CDC25A在犏牛睾丸组织和生精细胞中的表达量均极显著低于牦牛（P＜0.01);RT-PCR克隆分别获得牦牛、犏牛CDC25A基因序列1749 和1744 bp，其中CDS区均为1434 bp，均编码477个氨基酸；采用邻接法构建的系统进化树结果表明，牦牛、犏牛CDC25A基因与野牦牛亲缘关系最近。CDC25A蛋白含有负电荷残基（Asp+Clu）总电荷为73，正电荷残基（Arg+Lys）总电荷为66，无跨膜结构，无信号肽结构，且均属于不稳定的亲水性胞外蛋白。亚细胞定位结果显示，其主要分布于细胞核。【结论】CDC25A基因在牦牛、犏牛睾丸组织和生精细胞中的表达量具有极显著差异，但基因序列和结构差异与母本牦牛基本一致，说明精子发生阻滞并非基因突变导致，而是与CDC25A表达量降低有关。该结论可为后续研究CDC25A参与犏牛生精细胞增殖机制提供参考，也为研究犏牛雄性不育提供新思路。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
夏荣欣 李悦 刘婷婷 孙宣 钟黄欣 郭文晴 曾诚 张国敏
[目的]本实验旨在探究神经介素B（neuromedin B， NMB）及其受体[神经介素B受体（neuromedin B receptor， NMBR）、胃泌素释放肽受体（gastrin releasing peptide receptor， GRPR）和蛙皮素受体（bombesin receptor subtype 3， BRS3）]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节的机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只（3和9月龄，各6只）进行阉割并采集睾丸组织，在NMB及其受体基因克隆与序列分析的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于七次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低（P<0.05），而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增高（P<0.05）。[结论]NMB及其受体可能参与山羊睾丸发育的调节，丰富了家畜生殖生理学的研究。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曾诚 夏荣欣 李悦 刘婷婷 孙宣 钟黄欣 郭文晴 张国敏
[目的]本试验旨在探究神经介素B(NMB)及其受体NMBR[还包括胃泌素释放肽受体(GRPR)和蛙皮素受体(BRS3)]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只(3月龄和9月龄，各6只)进行阉割并采集睾丸组织，在克隆NMB及其受体基因与分析序列的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和Western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于7次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。[结论]NMB及其受体可能参与山羊睾丸发育的调节。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘亮 苏晓彤 李慧贤 胡康瑶 陆宏辉 许新松 万永杰
[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)对湖羊睾丸间质细胞(leydig cells, LC)的毒性作用。[方法]用200μmol·L~(-1) ZEA处理湖羊LC 8 h,通过EdU法检测细胞增殖情况，RT-qPCR和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m~6A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LC活性和增殖数量极显著下降(P<0.01);细胞增殖相关基因pcna及其蛋白表达水平均极显著下降(P<0.01);促凋亡基因表达水平(bax、caspase3,P<0.01;tp53、caspase9,P<0.05)均显著升高，相对应蛋白表达水平(TP53、CASPASE9,P<0.01)极显著升高；抗凋亡基因bcl-2及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);氧化应激相关基因相对表达水平(cat,P<0.05;gsh-px、sod2,P<0.01)显著或极显著上升，其相关蛋白表达水平(SOD2,P<0.01)极显著上升；m~6A相关基因alkbh5的相对表达水平显著降低(P<0.05),mettl3和ythdc1水平极显著升高(P<0.01),ythdf3水平显著升高(P<0.05)。[结论]ZEA可抑制湖羊LC增殖，促进湖羊LC凋亡，导致LC发生氧化损伤，产生毒性作用，且其毒性作用可能跟m~6A甲基化修饰相关。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏晓彤 李慧贤 胡康瑶 刘亮 万永杰
[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEA）对湖羊睾丸间质细胞（Leydig cells， LCs）的毒性作用。[方法]试验采用湖羊LCs为试验材料，用200 μmol·L~(-1) ZEA 处理8 h，通过Edu法检测细胞增殖情况，qRT-PCR 和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m~(6)A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LCs细胞活性和细胞增殖数量极显著下降（P＜0.01）；细胞增殖相关基因pcna相对表达量及其相关蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01）；促凋亡基因相对表达量升高（bax、caspase3，P＜0.01；tp53、caspase9，P＜0.05），其相关蛋白表达水平升高（TP53、CASPASE9，P＜0.01）；抗凋亡基因bcl-2相对表达量及其相关蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；氧化应激相关基因相对表达量上升（cat，P＜0.05；gsh-px、sod2，P＜0.01），其相关蛋白表达水平上升（SOD2，P＜0.01）；m~(6)A相关基因的相对表达量alkbh5显著降低（P＜0.05）、mettl3和ythdc1极显著升高（P＜0.01）、 ythdf3显著升高（P＜0.05）。[结论]ZEA可抑制湖羊LCs增殖、促进湖羊LCs凋亡，导致LCs发生氧化损伤，产生毒性作用，且其毒性作用可能跟m~(6)A甲基化修饰变化相关。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
金帅 郭宪 包鹏甲 梁春年 吴晓云 刘建 阎萍
【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt...
[期刊] 华北农学报
[作者]
党鹏举 李少斌 王继卿 刘秀 洪魏 胡江 罗玉柱
为探讨ＨＩＦ－２α基因核苷酸序列变异与绵羊高原适应的相关性，以５４０只（甘肃高山细毛羊２００只，湖羊３４０只）绵羊为研究对象，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术分析ＨＩＦ－２α基因第１１外显子和内含子部分区段在甘肃高山细毛羊和湖羊中单核苷酸多态性（ＳＮＰＳ）。结果显示：ＨＩＦ－２α基因扩增片段在２个绵羊品种中共检测到４种等位基因（Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ）和１０种基因型（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、ＡＤ、ＢＤ和ＣＤ），存在６个ＳＮＰＳ位点，其中外显子１１检测到５个ＳＮＰＳ位点（Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ａ、），内含子１１检测到１个ＳＮＰＳ位点（Ｇ／Ａ），甘肃高山细毛羊未检测到ＤＤ基因型。２．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李杰 任航行 王高富 蒋婧 孙晓燕 周鹏
【目的】为阐明同一个miRNA簇基因(miR-665,miR-127-5p,miR-136-3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433)在不同组织山羊表达特征和成肌细胞中表达水平。【方法】本研究采用qRT-PCR方法检测miRNA簇基因在山羊组织以及C2C12细胞不同生肌时间点的动态表达模式。【结果】miRNA簇基因(miR-665,miR-127-5p,miR-136-3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433)在不同波尔山羊组织中均广泛表达。miR-127-5p,miR-136-3p, miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433在山羊肌肉中高表达,miR-136-5p和miR-665在肌肉表达量低。miR-136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐渐升高;miR-127-5p,miR-432-3p,miR-432-5p,miR-433和miR-136-5p表达量呈现先升高后降低的趋势;miR-665在随C2C12细胞增殖和分化表达逐渐降低。【结论】本研究结果为进一步阐明miRNA簇基因调控骨骼肌的生长发育的调控功能奠定了理论基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵为民 涂枫 方晓敏 王学敏 付言峰 李碧侠 周李生 任守文
运用RT–PCR技术克隆猪PKM2基因的编码区序列,对该序列进行生物信息学分析,研究PKM2基因的组织表达及亚细胞定位。结果显示:猪PKM2基因CDS全长1 596 bp,编码531个氨基酸;预测其蛋白相对分子质量为5.79×104,等电点为7.96,含有多个磷酸化位点,为稳定蛋白;PKM2蛋白含有丙酮酸激酶家族的barreldomain和alpha/beta domain 2个结构域,其蛋白二级结构中α–螺旋和无规则卷曲占主要类型;猪PKM2蛋白序列在物种间非常保守,系统进化树分析表明,该蛋白与兔的亲缘关系最近;组织表达显示,猪PKM2基因在肾、小肠中相对高表达,而在肝脏与肌肉中相对低表达;亚细胞定位显示,PKM2蛋白在猪3D4/21和PK15细胞中表达于细胞质,而不表达于细胞核。
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