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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
汤海洋 张彦明 汪蕴 刘亚兵 丰美福
在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵正阳 刘娜女 李海红 奚绪光 范三红
【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌（Deferribacter desulfuricans）解旋酶DePif1，并对其结合与解旋DNA的活性进行分析，为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体，获得重组融合表达载体pET15bSUMODePif1，然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达；利用NiNTA亲和层析柱获得融合蛋白，SUMO蛋白酶酶切去除融合标签，再经Heparin和NiNTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白；采用荧光各向异性分析，研究pH和Na...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭娜 肖向红 徐义刚 柴龙会 张晶钰
【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、...
关键词：
东北林蛙 抗菌肽 毕赤酵母 抑菌活性
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王帅锋 刘娜女 段晓磊 罗亦欣 范三红 奚绪光
【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓＴｏｎｉｉ ｈ．）Ｐｉｆ１解旋酶（ＴｙＰｉｆ１），研究ＴｙＰｉｆ１解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将ＴｙＰｉｆ１解旋酶编码区和ｓｕｍｏ促溶标签编码区融合连入ＰｅＴ１５ｂ获得重组表达载体ＰｅＴ１５ｂ－ｓｕｍｏ－ＴｙＰｉｆ１，将该重组载体导入大肠杆菌ｂｌ２１（ｄｅ３）菌株诱导表达，经ｎｉ－ｎＴＡ柱亲和纯化获得融合蛋白，ｓｕｍｏ蛋白酶切除标签，再经ｎｉ－ｎＴＡ柱去除标签蛋白及ｓｕｍｏ蛋白酶，经ｈｅＰＡｒｉｎ柱进一步纯化最终获得ＴｙＰｉｆ１全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（Ｃｄ）和荧光共振能量转移（ｆ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。
关键词：
HLA-G 原核表达 重组蛋白 包涵体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
何华伟 王叶菁 侯丽 李瑜 位曙光 赵朋 蒋文超 赵萍
【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分
关键词：
家蚕 碱性磷酸酶 表达纯化 结构 性质
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ ｓｅｍｉｌａｅｖｉｓ）进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎性别相关基因ＣｓＦＲ２，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究ＣｓＦＲ２基因的功能，本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体ｐ ｅＴ－３２ａ－ＣｓＦＲ２，转化到大肠杆菌ｅ．Ｃｏｌｉ进行诱导表达，用Ｈｉｓ ＴＲａｐ进行蛋白纯化，ｓＤｓ－ｐａｇｅ电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的ＣｓＦＲ２蛋白注射１龄半滑舌鳎精巢。由于ＣｓＦＲ２是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Ｃｙｐ１９ａ和Ｆｏｘｌ２的表达量变化，来．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张小梅 韩念法 张美祥 李广录 范三红 郭蔼光
从经水杨酸处理的拟南芥开花期植株中获得cDNA,扩增得到Alpha-dioxygenase 1(DOX1)基因,进行原核表达、纯化和生物活性检测。利用原核表达载体pMAL-c4x在T7 Express CompetentE.coli和BL21(DE3)-RIPL codon+菌株中表达DOX1,经Amylose Resin亲和层析柱纯化。SDS-PAGE结果表明,重组融合蛋白在BL21(DE3)-RIPL codon+中的表达通过灰度值比较分析以可溶性为主,表达率约3.7%,纯化的DOX1纯度可达45%。愈创木酚法表明,可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性;2,4-DNP法测试表明可溶性重组蛋白...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张鹏 曹立雪 陈宏 马润林
通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。
关键词：
fat-1基因 线虫 原核表达 抗体制备
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘慧娟 郭晓军 郭妍妍 朱宝成
为进一步探讨全长基因和成熟肽基因的关系,根据已发表的假蕈状芽孢杆菌34 kDa纤溶酶全长基因DNA序列(GenBank FJ463037)和纤溶酶活性位点的位置,设计合成一对引物,扩增得到纤溶酶成熟肽基因G(951 bp编码317个氨基酸),连接pET-28a构建pET-28a-G载体,热激转化大肠杆菌BL21,成功获得pET-28a-G/BL21工程菌。终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测表达在胞内的融合蛋白,融合蛋白表观分子量约为40 kDa,符合所预测的结果。诱导菌体超声破壁后用纤维蛋白平板法检测表达产物具有纤溶酶活性,镍柱亲和层析纯化后的目的产物仍保留纤溶...
[期刊] 水产学报
[作者]
李丹彤 谢广成 丁文勇 王秀利 刘洋 徐文琦 张永攀
为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni2+离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵秀平 李国瑞 王双 闫星伊 段强 张帅 风兰 韩雯毓 孙佳欣 陈永胜
【目的】稻瘟病菌MSP1是由MGG-05344基因编码的一种与稻瘟病菌的植物毒性相关的蛋白,本研究进一步探索MSP1的晶体结构、功能以及与该蛋白相关的研究。【方法】对NCBI数据库提供的MSP1氨基酸序列进行生物信息学分析,构建原核表达载体pETSUMO_1b-MSP1,并对该重组蛋白进行诱导表达和纯化处理。【结果】MSP1分子量约为14.2 KD,等电点为4.6,为不稳定性疏水蛋白;含有信号肽,无跨膜结构域,为非典型分泌蛋白;含有11个磷酸活性位点,含有Cerato-platanin保守结构域,属于Cerato-platanin家族成员。该蛋白可被0.3 mmol/L IPTG诱导表达,镍离子亲和层析的最适洗脱条件为20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 80 mmol/L、100 mmol/L咪唑;阴离子交换层析表明该蛋白具有耐低盐性;分子筛层析具有单峰且对称性良好,最大峰在17.1 mL出峰,分子量约20 KD,表明MSP1以单体形式存在。【结论】本研究最终纯化得到大量高纯蛋白,以期为进一步探索该蛋白的晶体结构、功能、互作蛋白以及与稻瘟病菌毒性相关的后续研究奠定理论与实践基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李康 郭海磊 奚绪光
【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl_2、反应温度37℃。在此条件下,2种同源DHX36均可结合多种类型核酸底物(ssRNA、ssDNA、parallel G4、anti-parallel G4),且BtDHX36结合平行结构G4底物(parallel G4)的倾向更明显,DmDHX36无此趋势;2种DHX36解旋酶结合不同长度ssDNA的能力不同,BtDHX36更倾向于结合较长的单链DNA底物,而DmDHX36更倾向于结合较短的单链DNA底物;二者均能高效解旋dsRNA和dsDNA底物,DmDHX36更倾向于解旋dsDNA,而BtDHX36无明显倾向性。【结论】成功表达并纯化了BtDHX36和DmDHX36蛋白,确定了其最适结合条件,比较了2种DHX36解旋酶对不同底物的结合及解旋偏好。
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