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[期刊] 中国农业科学  [作者] 黄程  杨龙峰  孙鹏  程慧敏  杨志远  林健  祝洪伟  刘立新  孙厚民  李加凤  赵际成  段会娟  潘洁  刘月焕  
【目的】建立H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)实验感染模型,了解犬流感的发病特征,为疫苗效力评价奠定基础。【方法】6—13月龄CIV血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)抗体阴性(HI
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 张子卉  贾琪  连朋敬  李静云  徐彤  白玉  李鸿儒  乔健  
旨在分析环境低温对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠致病性的影响。选用120只6~8周龄,雄性SPF BALB/c小鼠,随机分为4组:无感染常温组(PBS处理,(20±2)℃)、无感染低温组(PBS处理,(10±2)℃)、H9N2病毒感染常温组(H9N2处理,(20±2)℃)、H9N2病毒感染低温组(H9N2处理,(10±2)℃)。在感染后观察感染小鼠发病14d内的临床症状、存活率,肺脏病变程度、肺部细胞因子含量的动态变化以及肺脏病毒载量。结果表明:1)与H9N2病毒感染常温组小鼠相比,环境低温处理的H9N2病毒感染小鼠临床症状明显加重,其中体重明显降低,但差异不显著(P>0.05),存活率由95%降为67%,肺水肿程度和肺组织病变程度更加严重;2)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺脏TNF-a和IL-1β含量无显著差异,但均显著高于2个无感染组(P<0.01);3)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺组织病毒载量显著增加(P<0.01)。综上,环境低温明显增加了H9N2亚型流感病毒对小鼠的致病性,为进一步揭示环境低温与流感病毒感染之间的关系,以及采取有效的预防措施提供数据基础。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 展小过  乔传玲  杨焕良  陈艳  孔维  辛晓光  陈化兰  
【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 李登云  孙岩  蒋鹏飞  亢展展  王静娜  华琳琳  张洋  张德礼  
【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏CDK9基因表达的影响,揭示流感发病机制与CDK9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感染7d后,仔猪肺脏CDK9的mRNA和蛋白表达的变化,并在电子显微镜下观察CDK9阳性细胞的定位。【结果】实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪7d后,肺脏组织内CDK9基因mRNA的相对表达量分别为0.42和0.36,与对照(1.0)相比显著降低(P<0.05)。半定量免疫组织化学检测结果显示,仔猪受到H3N2和H1N1...
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 赵丹  邱冬  韩德敏  刘永杰  
[目的]为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H_3N_2亚型犬流感病毒(CIV),制备具有犬源抗体恒定区基因(Fc)的鼠/犬嵌合抗体。[方法]从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链和轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得单链抗体基因(scFv)片段,同时从犬外周血单核细胞中扩增得到犬源抗体Fc片段;分别构建单链抗体与嵌合抗体表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化后调整蛋白浓度为1 mg·mL~(-1),检测单链抗体与嵌合抗体的ELISA和血凝抑制(HI)效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。[结果]获得的H_3N_2亚型CIV鼠源scFv的相对分子质量为45×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶640(1.56μg·mL~(-1))和1∶160(6.25μg·mL~(-1)),中和效价为1∶160(6.25μg·mL~(-1));鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的相对分子质量为80×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶2 560(0.39μg·mL~(-1))和1∶640(1.56μg·mL~(-1)),中和效价为1∶40(25μg·mL~(-1))。[结论]成功制备了H_3N_2亚型CIV鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的临床治疗提供了物质基础。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 丁佩佩  刘月焕  陈明勇  韩春华  林健  韩婧雯  潘洁  
【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...
[期刊] 西南农业学报  [作者] 朱买勋  张邑帆  付利芝  徐登峰  周雪  
【目的】明确H3N2型SwIV对仔猪组织脏器引起的损伤变化及其在组织中的载毒情况。【方法】试验采用H3N2型SwIV接种鸡胚扩增病毒,Reed-Muench法检测病毒EID_(50),滴鼻感染H1N1和H3N2抗体为阴性的仔猪,5 d后剖解观察仔猪临床病理变化,RT-PCR检测病毒在主要组织脏器中的载毒情况。【结果】感染H3N2型SwIV仔猪在5 d内未出现典型的临床症状,但是其肺脏组织有明显淤血和损伤坏死,肺泡壁增厚,肺泡内有纤维性渗出物和炎症细胞的聚集。组织中载毒检测结果显示主要载毒于肺脏组织中。【结论】感染H3N2型SwIV仔猪不一定出现典型临床症状,但其组织受到严重损伤,且主要载毒于肺脏组织。
[期刊] 华北农学报  [作者] 鄢明华  李秀丽  韩伟  高荣玲  申树权  陈龙宾  侯俊辉  王东  
用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ3/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)株。这3株病毒都为热不稳定型,60℃作用10 min即可使病毒失去感染能力,病毒对酸性环境(pH3.0)和乙醚均...
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 孙洪磊  佟琪  余海莉  韩琪祺  李涵  常昊宇  屈亚锦  徐杰  刘思当  刘金华  
新型禽流感病毒对家禽养殖业可造成严重经济损失,及时发现和阻断其传播具有重要意义。2022—2023年,本实验室在我国发病鸡群中监测到新型H3N3亚型禽流感病毒的出现和传播。本研究对发病鸡群开展了临床发病情况调查,对分离病毒进行了全基因组演化分析,并对分离的代表性病毒进行了鸡致病性以及空气传播性试验。结果表明:1)H3N3最早于2022年12月在华东地区发生产蛋下降的蛋鸡群出现,随后陆续在华东、华北、东北等多个地区的鸡群中监测到,发病群体主要为产蛋鸡,鸡群发病率高,死亡率低(1%~5%),主要引起产蛋率急性下降(10%~40%)。2)病毒全基因组序列分析显示,H3N3病毒为新型重排病毒,由鸡群中流行的H3N8病毒与H10N3病毒重排产生,6个内部基因来源于H9N2病毒。3)与H3N8病毒类似,新型H3N3病毒对鸡群高度易感,可在鸡鼻甲、气管、肺等呼吸器官中高效复制并排毒,引起呼吸系统严重病理损伤。4)空气传播性结果表明,新型H3N3病毒可在鸡群之间空气传播,而H3N8病毒不能在鸡群间空气传播。综上,新型H3N3禽流感病毒对鸡具有较强的致病性和传播性,有可能成为新的优势流行病毒,对我国家禽养殖业威胁较大,需要开展进一步的防控研究。
[期刊] 西南农业学报  [作者] 孔子荣  李凡  李三木  何奇松  曾咏芳  杨可妍  冯淑萍  孙翔翔  熊毅  颜健华  
【目的】了解广西H9N2亚型猪源流感病毒的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为有效防控猪流感提供参考依据。【方法】运用PCR方法扩增广西2株H9N2亚型猪源流感病毒(A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011)的HA基因,并进行克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树。【结果】2株H9N2亚型猪流感分离株的HA基因全长1701 bp,开放阅读框(ORF)全长1683 bp,编码560个氨基酸;与参考毒株核苷酸的同源性在83.7%~98.3%,推导氨基酸同源性在86.6%~98.2%。遗传进化树分析结果显示,2株分离株与A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同属欧亚谱系的Y280亚系,其HA基因的裂解位点序列均为RSSR↓GLF,具有低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,2个位于HA2区;HA受体结合位点均具有人流感病毒和猪流感病毒特征。【结论】分离获得的广西2株H9N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangxi/P2/2011和A/Swine/Guangxi/P3/2011,其HA基因属于欧亚普系的Y280亚系,均具备典型的低致病性和与人流感受体结合特征。
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 孙洪磊  佟琪  李涵  韩琪祺  刘激雨  李佳琪  杨吉喆  刘金华  
为调查我国多个省份鸡群中发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状、产蛋鸡产蛋率急性下降为特征的传染性疾病的致病病原,本研究对发病鸡群进行流行病学调查,病原分离鉴定,病毒全基因序列分析,并对分离病毒进行了动物回归试验。结果表明:1)该病自2021年12月首先发现于广东省某三黄鸡群,随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份鸡群中发生,鸡群发病率高,后期易继发感染细菌,死亡率1%~10%;2)实验室初步诊断为H3N8亚型禽流感;3)全基因组序列分析表明,该病毒为新型禽流感病毒,系欧亚禽分支H3基因、北美禽分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因组成的三源重排病毒;4)新型H3N8病毒对SPF鸡高度易感,感染鸡表现为眼睑肿胀出血,轻微呼吸道症状;病理变化为哈德氏腺黏膜坏死,鼻甲、气管纤毛上皮细胞坏死,黏膜下层炎性细胞浸润,肺脏支气管肺炎;病毒可通过口咽和泄殖腔排毒,排毒时间为5~7d;病毒在鼻甲、气管和肺脏中可高效复制,并且可以在哈德氏腺等肺外脏器复制。综上,新型三源重排H3N8禽流感病毒对鸡高度适应,对呼吸系统致病性较强,应尽快开展系统的流行病学监测,及早对病毒的源头及传播途径进行防控,力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 黄欣梅  李银  赵冬敏  刘宇卓  杨婧  韩凯凯  
[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除...
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 王彪雄  苏惠娟  石丽娟  肖榕  周红波  索朗斯珠  
为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 王方昆  袁秀芳  王一成  张存  徐丽华  刘思当  
【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1(nonstructural protein1)基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒(H9N2)的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 王云鹤  包红梅  孙佳善  李雁冰  徐晓龙  王子龙  施建忠  曾显营  王秀荣  陈化兰  
【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Acce...
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