为了建立转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法,本研究根据已公布的转基因大豆GTS40-3-2的旁侧序列信息,用Primer 5.0软件在左右边界的结合位点处设计了5对引物组合,选取扩增片段为370 bp最佳引物组合后,优化了反应体系中引物浓度和退火温度。以Lectin为内标基因,验证检测引物的特异性及灵敏度,建立了转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法。结果表明,该方法成本低、效率高,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,已通过全国六家实验室的循环验证,能特异地检测大豆样品中GTS40-3-2转化体,最低限可达0.05%。研究表明,该方法满足我国转基...

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已获得中国进口加工原料安全证书，建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR）检测方法，为抗逆大豆IND-??41?-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-??41?-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针，结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针，随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选，遴选出1对候选引物探针；设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度，优化qPCR方法的反应体系；设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性；以纯合抗逆大豆IND-??41?-5基因组DNA作为标准样品，梯度稀释成标准溶液模板，绘制标准曲线，考察qPCR方法的线性动态范围，配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品，评价定量方法的准确性；配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品，测试方法的检出限；拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试，确定方法的定量限；最终确定抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证，采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性，利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合，建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性qPCR方法，扩增片段为138 bp，优化的反应体系引物终浓度为0.4μmol·L~(-1)、探针终浓度为0.2μmol·L~(-1);IND-??41?-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33—83 190 copies的基因组DNA，该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-??41?-5测试样品，偏差和相对标准偏差（RSD）均小于25%；确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强，检出限为0.05%，定量限为0.1%，且具备良好的实验室间重复性和再现性，经测量不确定度预评定后，获得5份抗逆大豆IND-??41?-5测试样品的测量结果分别为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，能够实现抗逆大豆IND-??41?-5转化体成分的精准定量检测。

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系，将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要，本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法，以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数；基于基因组重测序技术，采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点，插入方式为反向插入；结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列，基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列，方法快速、结果可靠，为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.83

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-G...

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNASYBRGreenI结合染料实时荧光定量PCR技术,扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因,绘制2种基因扩增的循环数拷贝数标准曲线图,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量;并作重现性和熔解曲线分析。结果表明,lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好,R2值分别达到0.9997和0.9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示,实测值与实际值接近,相对偏差5%～11%。SYBRGreenI实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。

【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50pg·μl-1,而...

根据抗草甘膦大豆ＭＯＮ８９７８８分子特征，选择大豆内源参照基因（ＬｅｃｔｉＮ）、玄参花叶病毒启动子（Ｐ－ＦＭＶ ３５Ｓ）、豌豆终止子（ｔ－ｅ９３＇）和目的基因（ｃＰ４－ｅＰＳＰＳ）４个基因作为复合ＰｃＲ检测基因，其特异性引物序列参照国家相关标准，对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。最终建立了可同时检测除内源基因在外的３种外源基因复合ＰｃＲ检测体系。

根据已发表的气单胞菌16SrDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列,设计了2对引物,建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测,发现16SrDNA引物具有高度的特异性,仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97.2%,且具有高度的敏感性,可检测最低1fg的模板。将16SrDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94.4%。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方...

根据 Jean-Dupouy-Camet 报道1.7 kb 基因序列而设计合成的引物,对中国9个地区(哈尔滨海伦猪株、哈尔演五常犬株、黑龙江孙吴猫株、长春犬株、沈阳猪株、河南南阳猪株、湖南十堰猪株、西安猪株、云南大理猪株)的肌组织旋毛虫 DNA 进行了聚合酶链式反应(PCR).扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见中国猪源旋毛虫均扩增出特异性的602bp 和230 bp 大小的 DNA 条带",而中国犬源和猫源以及正常对照肌组织 DNA 均未扩增出特异性片段.本法对中国猪源旋毛虫可检测到0.02条旋毛虫 DNA,具有高度的特异性和敏感性.

以转基因作物中常见的nos/plamid构建特异性序列为研究对象,通过同源性比较和焦磷酸测序dispensation order设计,建立Special-Base焦磷酸测序检测模型;利用转基因大豆Roundup Ready Soybean和转基因玉米Bt11、GA21、NK603等4种转基因作物为试验材料,针对nos/plamid构建特异性序列设计引物,经复合PCR扩增及焦磷酸测序,验证Special-Base焦磷酸测序检测模型有效性。结果表明:本研究建立的Special-Base焦磷酸测序模型能检测出样品中单一或多种转基因作物成分,提高了转基因作物检测的精确性、检测通量和自动化程度。

【目的】大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）是微生物肥料重要的功能菌种之一，可通过生物固氮为大豆生长提供氮素，实现节本增效，菌株5873作为其典型代表，已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌5873为供试材料，基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列，以及与其高度同源（基因组ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段，通过多重序列比对，进行特异引物设计和筛选，获得特异性引物对，并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测，建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法。然后，采用盆栽试验，将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际，应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′)，优化并建立了PCR快速检测方法，即反应体系：Premix Taq~(TM) 12.5μL，引物各1.0μL，基因组DNA 15 ng左右，加ddH2O补足至25μL；反应条件：95℃预热5 min,94℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环，再72℃延伸10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无（355和218 bp），即可实现大豆根瘤菌5873的快速检测，该方法检出灵敏度为1 850 CFU/μL。此外，借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力，与传统BOX-PCR评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌5873快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板，直接进行PCR扩增的鉴定操作，省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节，大大减少了工作量，只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873，为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。

为实现转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’转化体成分的精准定量检测,以转基因大豆‘ZH 10-6’的5′端边界序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针浓度进行优化,经特异性测试,建立了耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’的微滴式数字PCR检测方法。结果表明:1)特异性良好:只有以转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’基因组为模板才有扩增信号;2)灵敏度高:在相对标准偏差≤25%的情况下,方法的检出限(LOD)为13.0个拷贝;定量限(LOQ)为66.0个拷贝;3)PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R2>0.99,DNA含量线性范围为0.08%～100.00%。综上,本研究建立的转基因耐除草剂大豆‘ZH 10-6’转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高,可用于对转基因大豆品种‘ZH 10-6’的定量检测。

【目的】研究亚洲大豆栽培品种地理群体的遗传多样性、特异性和群体分化。【方法】应用大豆基因组64对SSR分子标记技术,对亚洲216份栽培大豆品种遗传变异进行分析。【结果】亚洲大豆栽培品种遗传多样性丰富,地理群体(中国东北、中国黄淮、中国南方、朝鲜半岛、东南亚、南亚)间存在较多互补等位变异数,最多的在中国黄淮与南亚群体间;各地理群体拥有各自特有或特缺的等位变异。亚洲大豆全群SSR标记遗传距离聚类(聚成6类)与地理群体分类间有极显著相关性,地理分群有其相应的遗传基础。亚洲全群由2类血缘组成,分别占中国国内和国外2大类群的绝大部分;地理群体间2类血缘组成的差异明显。国内与国外各群体间以中国南方与东南亚...