【目的】获得具有荧光标记的猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)菌株,为进一步揭示其侵染致病过程奠定基础。【方法】电击法对病菌进行GFPuv基因标记,应用荧光显微镜和平板稀释法研究标记菌株在土壤和根部的定殖情况。【结果】GFPuv标记的猕猴桃溃疡病菌菌株在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,8株标记菌基因组DNA中均扩增出约700 bp的目的片段。标记菌株PSAmx7-GFPuv1的菌体形态、生长曲线、最适温度、最适pH、致病性均与野生型无显著差异,其绿色荧光可稳定遗传。标记菌在灭菌土壤中可存活3个月左右,在未灭菌土壤中也能存活3周;灌根1 d检测,...

【目的】研究高效筛选猕猴桃溃疡病致病菌的新方法对湘西地区感染溃疡病的猕猴桃植株进行快速病菌分离与鉴定。【方法】以一年生猕猴桃枝条对不同糖浓度和氮浓度基质耐受情况为依据和柯赫氏法则来验证高效筛选病原菌方案的可行性与提取经筛选得到猕猴桃溃疡病病菌的DNA并扩增16Sr DNA进行系统发育树分析。【结果】本实验得到一高碳氮比(C∶N=10∶1)的筛选培养基,其对猕猴桃溃疡病致病菌筛选效率优于目前已报道的筛选基质;经筛选获得溃疡病致病菌为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种,与目前已报道的丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种亲缘

分离猕猴桃溃疡病菌中的质粒,从质粒角度探索细菌的致病机制,分析其编码的主要基因、毒力因子。用试剂盒提取分离自安徽省岳西县猕猴桃溃疡病菌株JF8的质粒,对质粒DNA进行高通量测序及生物信息学分析。质粒基因组拼接显示菌株JF8质粒全长65 149bp,GC含量56.29%,包含45个假定蛋白(hypothetical protein)和38个有预测功能的蛋白。生物信息学分析发现,质粒携带多达8个直接参与基因重组和转移的转运蛋白(mobile element protein),5个基因直接参与细菌Ⅳ型分泌系统、1个基因参与细菌Ⅲ型分泌系统。基因ParA编码的蛋白是一个ATP酶,对质粒的分配以及维持质粒稳定具有重要作用,编码转录激活蛋白的基因LuxR与细菌的群体感应机制相关,影响毒力因子的表达和分泌,基因UmuC是细菌中SOS应答系统的组分之一,控制细胞中聚合酶Ⅴ的量。

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害。近年来,该病在新西兰和意大利等猕猴桃出口大国爆发,并有世界范围内进一步扩散之势,给猕猴桃产业的发展造成了严重威胁。笔者基于国内外最新的研究报道,对猕猴桃细菌性溃疡病的发病症状、病原鉴定、快速检测方法、致病力差异、病原菌侵染机理、病害发生流行规律及防治技术等方面进行了综述,并探讨了该病害未来的研究方向与防治策略。

【目的】探讨多羟基双萘醛提取物(WCT)对猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonassyingae pv.actinidiae)的抑制作用。【方法】采用平板抑菌圈法和猕猴桃苗盆栽接菌的方法,测定WCT对猕猴桃溃疡病菌生长的抑制作用,并在7年树龄的猕猴桃树上进行田间药效试验,分析WCT对猕猴桃苗各处理的多酚氧化酶(PPO)与过氧化氢酶(POD)活性及病程相关蛋白的诱导情况。【结果】WCT对猕猴桃溃疡病菌的抑制中浓度(EC50)为11.5 mg/mL;猕猴桃苗接种WCT和病原菌后,其PPO和POD活性均保持在较高的水平,其中WCT预防处理的PPO和POD活性均较其他处理高;SDS-PAGE电泳分析结果...

【目的】研究与猕猴桃抗溃疡病基因连锁的SSR分子标记,为猕猴桃抗病育种提供早期分子筛选标记。【方法】以易感病的雌株西选二号和抗病的雄株SX45872杂交F1代的198株群体以及40份猕猴桃材料为试材,利用离体接种法进行抗性鉴定。利用SSR(Simple sequence repeat)技术,结合集群分类分析法(Bulked segregation analysis,BSA)进行猕猴桃抗溃疡病基因(PR)分子标记筛选。【结果】抗性鉴定结果表明,猕猴桃溃疡病抗/感病分离比符合由1对主效基因控制的1∶1分离比例。通过对51对SSR引物的筛选,获得了与抗溃疡病基因连锁的SSR分子标记UDK97-428...

为明确猕猴桃细菌性溃疡病致病菌种类与特征,以从安徽岳西、陕西户县和重庆黔江等猕猴桃主产区收集到的溃疡病感染枝条和树皮为材料,采用平板划线、梯度稀释和BPA培养法分离病原物,采用烟草过敏性反应和猕猴桃健康叶片接种观察其致病性,结合特异引物扩增的16S-23SrDNA-ITS序列分析,对病原菌种类进行分子鉴定。结果表明:从收集的溃疡病感染枝条和树皮中,共分离纯化得到10株分离物;所有分离物均可使烟草叶片产生过敏反应,猕猴桃叶片接种显示同一菌株对不同品种及不同菌株对同一品种的致病力均存在差异。对特异扩增得到的280bp 16S-23SrDNA-ITS序列进行Blast比对分析,结果表明:10个菌株为...

从患溃疡病养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出3株优势菌(RH1、RH2、RH3),以浸浴、体腔注射、体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株RH2为养殖刺参溃疡病的病原菌,其对刺参的LD50(半数致死量)每尾为5.68×106CFU,并证实浸浴、体腔注射的方式无法感染刺参,该菌可能通过体表创伤侵入的方式感染刺参。经形态学观察、生理生化特性分析、16SrRNA和HSP60基因测序确定菌株RH2为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。基于16S rRNA基因构建的系统发育树显示,菌株RH2与溶藻弧菌(AF513447)亲缘关系最近,置信度为50%;...

【目的】由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害。病原细菌主要通过Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）将多种效应蛋白（T3SS effector,T3SE）注入寄主植物细胞，进而促进病菌侵染和致病。本研究旨在解析Psa基因组中T3SE的信息并对其T3SS和T3SE的致病功能进行系统分析，为溃疡病菌致病机制的研究和防治策略的制定提供依据。【方法】利用marker-free同源重组基因敲除技术获得M228菌株的T3SS功能缺陷突变体ΔhrcS和ΔhrcC，观察突变体在寄主上的致病力，同时检测突变体诱导本氏烟产生细胞坏死的情况；随后利用从Pseudomonas-Plant Interaction数据库下载的T3SE数据库，本地BLAST多序列比对构建强、弱致病菌株M228和M227的T3SE库，并对二者的T3SE基因信息进行比对分析；另外，获得M228菌株T3SE单、多效应子突变菌株20株及2株HopR1基因回补菌株（共涉及19个T3SE），并将各突变体室内有伤接菌猕猴桃枝条，系统评价各突变体致病力变化并进行统计分析。【结果】通过对Psa的hrcS和hrcC基因进行突变，证明T3SS是其在寄主上致病以及非寄主上过敏性坏死反应（HR）所必需的。通过数据库同源比对，发现在强毒株系和弱毒株系中有31个T3SE基因具有100%的同源性，选取一些基因进行缺失突变，发现hopM1/avrE1和hopR1是Psa重要的毒性因子，且二者不存在功能冗余。另外，单独敲除avrPto5或avrRpm1均能提高Psa致病力。在缺失A-F-E基因簇和avrPto5的菌株中，敲除hopM1/avrE1和hopR1也分别导致Psa的致病力显著下降；而同时敲除hopM1/avrE1、hopR1、avrPto5和A-F-E基因簇导致病菌完全丧失致病力。【结论】HopM1/AvrE1与同家族HopR1均为Psa重要致病因子，且独立于其他效应子发挥作用；avrPto5和avrRpm1基因缺失可以增强Psa的致病力。

新西兰是世界猕猴桃第三大生产国,第一大出口国,然而2010年11月起新西兰发生的细菌性溃疡病(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)正在对新西兰猕猴桃产业带来严重威胁。本文介绍新西兰溃疡病的发生现状,其中包括:溃疡病对新西兰猕猴桃的危害、病菌发生的症状及特点和新西兰对溃疡病的应对措施,分析并提出了新西兰溃疡病影响较大的可能原因。

　采用室内抑菌试验与田间喷雾、病斑涂抹和灌根等试验相结合的方法,研究了防治猕猴桃溃疡病的有效药剂种类及其优化施用技术。结果表明,95%CT原粉、60%DTMzWP和1000万单位农用链霉素的室内抑菌效果较好;田间以95%CT原粉500倍液刮除病斑涂药防治效果最好,治愈率达94.3%,其次为DTMZ、农用链霉素和菌毒清;不同施药方法组合中,以喷雾+刮除病斑涂抹组合的防治效果最好,最高防效可达96%;秋季采用注射法,可有效预防翌年早春猕猴桃溃疡病的发生危害。

【目的】为四川猕猴桃产区制定科学、合理、综合防控溃疡病策略提供理论依据。【方法】本试验以‘红阳’猕猴桃溃疡病高发园为研究对象,比较了避雨栽培、复配化学药剂、不同时期冬剪及剪口保护方式、土施生物菌剂等田间措施在溃疡病上的防控效果。【结果】①避雨栽培可显著降低红阳猕猴桃溃疡病病情指数,并随盖棚年份增加,防控效果更明显,盖棚后第3年棚内溃疡病发生率为0,但避雨栽培需做好肥水精准管理。②复配化学药剂试验中,分别于采果前20 d,采果后7～10 d以及萌芽期(2月)喷施2%春雷霉素300倍+43%戊唑醇1000倍+56%丙森醚菌酯600倍+45%咪酰胺1500倍3次或80%全螯合态代森锰锌800倍+0.15%四霉素1200倍+50%嘧菌环胺800倍3次的病情指数为4.67和5.67,均极显著低于CK(病情指数为17.00)。③适当提早冬季修剪时期并对剪锯口喷0.15%四霉素、2%春雷霉素或全树涂抹勃生肥对溃疡病防控效果均不理想。④采果后15 d和萌芽期,将生物有机肥、复合微生物肥、芽孢杆菌悬浮液和中药复配剂混合土施,对溃疡病防控效果也不理想。【结论】避雨栽培以及两种复配化学药剂均可显著降低红阳猕猴桃溃疡病病情指数,避雨栽培有望成为四川盆地猕猴桃产区溃疡病主要防控措施。

【目的】为探明猕猴桃溃疡病抗性差异生理机制,并筛选猕猴桃溃疡病抗性相关指标。【方法】本试验以6个四川省主栽猕猴桃品种为试材,通过枝条离体接种和盆栽苗接种,鉴定其对溃疡病的抗病能力,并从枝叶形态结构、生理生化指标上剖析了抗性差异的生理机制。【结果】①6个猕猴桃品种枝、叶形态结构存在明显差异,叶片气孔密度、气孔长度与溃疡病离体接种试验病情指数呈极显著或显著正相关(相关系数分别为0.9636和0.8858),叶片海绵组织厚度与溃疡病离体接种试验病情指数呈极显著负相关(相关系数为-0.9442),而叶片上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、气孔宽度,枝条皮孔长度、皮孔宽度、皮孔密度、芽眼皮层厚度与溃疡病离体接种病情指数无显著相关性,皮孔形状亦未表现出明显的规律。②盆栽苗接种病原菌后枝条、叶片中SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均出现了不同程度升高。健康叶片、枝条韧皮部SOD、POD活性与溃疡病病情指数呈极显著或显著负相关(相关系数分别为-0.9563,-0.9680,-0.9517和-0.8088)。叶片CAT、PPO、PAL、枝条韧皮部CAT、PAL活性与溃疡病病情指数无显著性关系。枝条韧皮部PPO活性与溃疡病病情指数呈极显著负相关(相关系数为-0.9850)。溃疡病病菌接种前叶片、枝条韧皮部可溶性糖含量均与溃疡病病情指数呈显著负相关(相关系数分别为-0.9220和-0.8452),但叶片、枝条韧皮部可溶性淀粉与溃疡病病情指数无显著相关性。【结论】6个猕猴桃品种溃疡病抗性由强到弱依次为‘翠玉’、‘东红’、‘伊顿1号’、‘金果’、‘金艳’、‘红阳’。叶片气孔密度、气孔长度、叶片海绵组织厚度、叶片与枝条韧皮部SOD、POD活性、可溶性糖含量是评价猕猴桃抗溃疡病能力的有力指标。

【目的】杨树溃疡病是中国杨树人工林重大生物灾害之一,采用生物防治的方法控制杨树溃疡病是持续有效的手段。本研究旨在从杨树林地土壤中分离出对杨树溃疡病菌有良好生防效果的拮抗微生物。【方法】以杨树溃疡病病原菌葡萄座腔菌为靶标,进行土壤中生防微生物的分离、筛选和鉴定。土壤微生物的分离采用稀释平板涂布法;拮抗微生物的筛选分为初筛、发酵液复筛和拮抗菌株离体复筛3步,初筛采用平板对峙法,拮抗菌发酵液复筛选择三明治法和改良琼脂扩散法相结合的方法,最终通过离体组织防治效果测定确定目的生防菌株;生防菌株的鉴定采用形态学观察和分子生物学鉴定相结合的方法。【结果】在河北省廊坊市和河南省原阳县的杨树林地中按上、中、下3...

【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coliBL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要...