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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
索丽娟 胡建宏 王鹏 洪洁赟 王春伟 李青旺 史怀平
【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对小鼠精原干细胞(SSCs)体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶(AP)染色和RT-PCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF(添加量为0,10,20,40ng/mL)或LIF(添加量为0,500,1 000,1 500U/mL)的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加G...
[期刊] 水产学报
[作者]
王园 李名友 白孝明 屈锡梅 罗玉冰 王德寿 魏静
为探究视黄酸（RA）在鱼类精原干细胞（SSC）增殖与分化中的作用，实验首先以三色荧光报告载体pGRY [延伸因子1α启动子驱动组蛋白H2B-绿色荧光融合蛋白、减数分裂联会复合体蛋白3（Scp3）启动子驱动嘌呤霉素红色荧光融合蛋白、精蛋白启动子驱动黄色荧光蛋白] 转染青鳉精原干细胞系SG3，获得稳转细胞SG3-pGRY，然后分别在2D与3D培养条件下检测RA信号对其增殖与分化的影响。结果显示，稳转细胞SG3-pGRY的红色荧光可监测细胞内源性Scp3的表达，且细胞仍保持干性及分化潜能，表明其可用于监测细胞分化状态。在2D培养条件下，即在细胞培养板中待细胞生长密度约90%就进行传代培养，RA可显著抑制细胞增殖，其受体α、β、γ泛抑制剂BMS493可促进细胞增殖；第48小时，RA处理可下调细胞多能性相关基因pou5f3、klf4表达，上调减数分裂相关基因dazl表达，但对其他减数分裂相关基因如scp3表达无明显影响；第8天，处理组及对照组均未能观察到红色荧光，这与已有报道RA处理体外培养小鼠SSC可显著促进Scp3表达，并进入减数分裂I期偶线期的研究结果明显不同。在3D培养条件下，即用96孔球形低吸附微量培养板进行培养，48小时后细胞成球状体聚集生长，RA、 BMS493处理组、对照组在48 h后均观察到明显红色荧光，减数分裂相关基因表达与2D相比显著上调；第8与第34天，RA处理组减数分裂相关基因表达均显著高于对照组，而BMS493处理组低于对照组。研究表明，RA信号可抑制SG3增殖，促进其分化，但不是诱导细胞发生减数分裂的关键分子。本研究不仅为鱼类SSC分化相关研究提供了良好研究模型，而且促进了对于RA信号在鱼类SSC增殖与分化中作用的深入认识。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
阚飞 孙捷 田路旸 李超 徐明旭 房云 代陈胜 张克云
以中国药用昆虫白星花金龟(Protaetia brevitarsis)幼虫(蛴螬)为研究对象,通过匀浆、乙醇沉淀、Sevag法去除蛋白,得到蛴螬总多糖,其得率为57%。用苯酚硫酸法进行多糖浓度测定。经MTT法检测表明,终质量浓度为5和20μg.mL-1的总多糖对小鼠脾细胞的生长增殖率分别为48.8%和62.2%,对巨噬细胞生长增殖率分别为240%和516%。用DEAE-Sephadex A-25、LPLC-Sephadex G-75层析法分离纯化总多糖,得到5种蛴螬多糖,其中相对分子质量分别为42 000和26 000的2种蛴螬多糖对脾细胞生长增殖率较高,终质量浓度为5μg.mL-1的该2种多...
关键词：
蛴螬 多糖 免疫细胞增殖
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
孙秀柱 朱艳娇 杜丽娟 王立强 康孟阳 王淑辉
为探索提高精原干细胞分离和体外培养效率的技术方法,以建立长期稳定的动物精原干细胞培养体系,对动物精原干细胞的分离纯化和体外培养的研究进展进行综述。以"Spermatogonial stem cell,Isolation,Culture,Enrichment,in vitro"和"精原干细胞、分离、培养和体外扩增"为检索词,查阅精原干细胞相关文献,并进行归纳整理。精原干细胞分离主要有机械分离法和酶消化法,纯化精原干细胞的方法有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞法等,目前大动物精原干细胞的富集常
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李海军 靳木子 张睿彪 杜晨光 刘东军 仓明
【目的】探讨卵丘-卵母细胞复合体(COCs)形态、卵丘细胞凋亡与增殖状态和卵母细胞发育能力之间的相关性。【方法】根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞层数等形态指标,对所挑选的未成熟COCs进行分组,随后利用体外受精技术和TUNEL技术,并结合流式细胞仪,评价各组COCs的体外发育能力及其卵丘细胞凋亡和细胞周期差异。【结果】与包被5层以上致密卵丘且卵胞质均质的COCs相比,具有2—5层轻度扩散卵丘与颗粒化卵质特征的COCs显示较好的后续胚胎发育潜力、较高的卵丘细胞凋亡程度和较低的G2-M期细胞比率。【结论】卵丘细胞凋亡程度与未成熟卵母细胞发育潜能呈正相关;COCs形态、卵丘细胞凋亡或者G2-M期细胞比率...
关键词：
牛 胚胎发育 卵丘细胞 凋亡 增殖
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
易丹 曾申明 呙于明
为研究富含n-3或n-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)日粮对小鼠卵母细胞体外发育和线粒体功能的影响,把90只14g左右昆明雌鼠随机分为3组,分别饲喂40g/kg豆油日粮,40g/kg鱼油日粮或40g/kg共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)日粮30d;注射雌激素诱导小鼠超数排卵后,检测卵母细胞活性线粒体分布、线粒体钙浓度、膜电位以及脂肪滴分布;利用体外受精技术,评价卵母细胞体外发育能力。结果表明:相对于每个活性线粒体的分布,饲喂鱼油日粮的小鼠卵母细胞内层钙的分布比豆油日粮组有所升高(P<0.05),但是各组卵母...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
汤帅 杨淇 张宇航 唐午阳 郑晓峰 李丕顺
利用短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰技术构建3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)亚型基因(Akt1、Akt2、Akt3)敲低的小鼠胚胎干细胞(mESC)系，通过CCK–8法检测细胞活力；反转录荧光定量聚合酶链式反应(qRT–PCR)检测分化相关基因的表达；蛋白质印迹法(WB)检测多能性和分化相关蛋白的表达，研究Akt亚型基因敲低对mESC更新及分化的影响。结果表明：Akt1和Akt2的基因敲低不影响mESC的增殖和分化，但会抑制拟胚体(EB)内胚层和中胚层的形成；Akt2的基因敲低促进EB中后期外胚层的形成；Akt3的基因敲低会减缓mESC的增殖，但不影响多能性蛋白的表达，促进拟胚体中胚层和外胚层的形成。
关键词：
Akt 小鼠胚胎干细胞 增殖 分化
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
汤帅 杨淇 张宇航 唐午阳 郑晓峰 李丕顺
利用短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰技术构建3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)亚型基因(Akt1、Akt2、Akt3)敲低的小鼠胚胎干细胞(mESC)系，通过CCK–8法检测细胞活力；反转录荧光定量聚合酶链式反应(qRT–PCR)检测分化相关基因的表达；蛋白质印迹法(WB)检测多能性和分化相关蛋白的表达，研究Akt亚型基因敲低对mESC更新及分化的影响。结果表明：Akt1和Akt2的基因敲低不影响mESC的增殖和分化，但会抑制拟胚体(EB)内胚层和中胚层的形成；Akt2的基因敲低促进EB中后期外胚层的形成；Akt3的基因敲低会减缓mESC的增殖，但不影响多能性蛋白的表达，促进拟胚体中胚层和外胚层的形成。
关键词：
Akt 小鼠胚胎干细胞 增殖 分化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
栾兆进 宋慧子 杜炜 赵勇超 王兆琛 张家新
【目的】探讨表皮生长因子(EGF)对体外培养的绵羊附睾上皮细胞(EECs)增殖的影响。【方法】分离培养EECs,利用免疫荧光检测角蛋白18(CK18)对分离的细胞进行鉴定,用CCK-8法测定EGF的最佳作用质量浓度,用RT-PCR检测EECs中附睾分子标记——谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPX5)和雄激素受体(AR)基因的表达情况,用流式细胞仪法检测EGF对EECs细胞周期和凋亡的影响。将P_4代EECs分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Gefitinib、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路抑制剂LY294002和DMSO(对照组)处理后,再用EGF培养,用流式细胞仪法检测细胞周期和凋亡情况。将P_4代EECs分别用EGF(-)、EGF、EGF+Gefitinib和EGF+LY294002处理后,用Western blot检测细胞中EGFR、AKT和叉头盒蛋白O1(FOXO1)磷酸化水平。【结果】分离培养的EECs可表达CK18,细胞纯度较好;EGF对EECs增殖促进效应呈浓度依赖性,用含50 ng/mL EGF培养基培养的EECs具有最高的增殖潜能,且不同传代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR;EGF处理S期EECs细胞比例极显著升高(P<0.01),凋亡指数显著降低(P<0.05)。与对照组相比,Gefitinib组S期EECs细胞比例极显著降低(P<0.01),LY294002组S期细胞比例显著降低(P<0.05);Gefitinib组EECs细胞的凋亡指数极显著升高(P
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
辛颖 张涛 张优优 张智英
【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基...
关键词：
慢病毒 活体 精原干细胞 转基因小鼠
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
田垒 陈栋炜 季业伟 刘玺 张明徽 陈德坤
【目的】探讨细胞毒性T细胞(CTL)表位肽SIINFEKL浓度和树突状细胞(DC)数量对CD8+T细胞活化和增殖的影响。【方法】用小鼠重组粒细胞集落刺激性生物因子(GM-CSF)和IL-4诱导骨髓细胞来源的DC增殖和分化,将所得成熟树突状细胞(maDC)和SIINFEKL抗原肽,与免疫磁珠法分离的OT-I小鼠CD8+T细胞共培养。用不同质量浓度的SIINFEKL(100,10,1,0.1,0.01和0.001 ng/mL)或不同数量的DC(DC/T比例分别为1/20和1/5)与CD8+T细胞共培养,刺激CD8+T细胞增殖分化。于共培养不同时间收集细胞,流式细胞术测定CD8+T细胞的数量、分裂速...
关键词：
抗原浓度 树突状细胞 CD8+T细胞
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杜军慧 曹文广
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)是借助基因导入技术将某些转录因子导入人或动物的体细胞,使体细胞重编程而得到的多能性细胞。iPS细胞来源丰富,研究表明利用不同的载体诱导系统或不同的转录因子组合,多种体细胞都可被重编程为iPS细胞,如成纤维细胞、肝细胞、角质细胞及脐带血细胞等。作为干细胞中新的一员,iPS细胞在克隆形态、基因表达模式、表面标志物、拟胚体形成、畸胎瘤及嵌合体形成(小鼠)、分化能力等方面与胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)非常相似。与胚胎干细胞一样,在特定的诱导条件下,iPS细胞在体外可被诱导分化为多种细胞...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王晶 商旋 张晓敬 常世民 马爽
研究不同浓度的氯化镉对体外培养的小鼠皮肤细胞存活影响。采用组织块法启动小鼠皮肤细胞的原代培养，胰酶消化法传代培养，利用光镜观察、ＭＴＴ细胞毒性分析、荧光染色和ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳等方法研究镉对小鼠皮肤细胞的毒性作用。结果显示，在３７℃，含２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养条件下，小鼠皮肤组织原代启动第２天即有细胞迁出，为成纤维样细胞形态，生长分裂旺盛，第６天即可长成汇合的细胞单层，并能稳定连续传代。２０～１６０μＭｏｌ／ｌ氯化镉可显著降低体外培养的小鼠皮肤细胞的存活率，具有浓度和时间的依赖性。处理２４和４８ ｈ对肝细胞的半致死率浓度分别为３９．８１和２２．３９μＭｏｌ／ｌ。ＣＤ Ｃｌ２处理导．．．
关键词：
镉 皮肤细胞 细胞培养 细胞凋亡
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
田海瑞 汪晶晶 李晓晓 张丹琛 邹康
[目的]本文旨在探讨猪支持细胞是否分泌外泌体，并利用体外模型检测支持细胞外泌体对猪精原干细胞（porcine Spermatogonial stem cells, pSSCs）命运的影响。[方法]通过两步酶消化法分离猪支持细胞和pSSCs并建立猪支持细胞-pSSCs体外共培养模型，抑制猪支持细胞外泌体的分泌，检测pSSCs自我更新及分化指标，明确支持细胞外泌体对pSSCs命运的影响。[结果]分离得到的支持细胞WT1阳性率为87.1%±0.02,ITGB1阳性率为94.2%±0.01，分离得到的pSSCs PLZF阳性率为80.6%±0.02；通过蛋白印迹分析、免疫荧光（Immunofluorescence, IF）证实支持细胞外泌体的存在；证实了20μM GW4869可以抑制外泌体分离且不损害支持细胞；处理后的支持细胞与pSSCs共培养发现，实验组较对照组pSSCs状态差异较为明显，且RT-PCR结果显示猪精原干细胞PLZF表达量显著升高；KIT、THY1、DDX4表达量显著降低；Western Blot结果显示猪精原干细胞PGP9.5表达量升高，DDX4表达量降低。[结论]结果表明体外培养时支持细胞分泌的外泌体对pSSCs自我更新和分化都具有调控作用，暗示外泌体是支持细胞调控精原干细胞命运的一种重要方式，这为种公猪生殖力的改善提供了新思路。
关键词：
猪 支持细胞 精原干细胞 外泌体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丛姗 王瑞 温建勋 郝斐 李硕 梁浩 刘东军
【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)和牛胎儿成纤维细胞(bovine embryonic fibroblast,BEF),用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚...
关键词：
牛 胚胎干细胞 成纤维细胞 混合饲养层
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