【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分，其生长发育直接影响畜禽肉产量，叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子，其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用，为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品，提取其RNA并反转录，利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞，通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒，以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达，其在成年牛的背脂中表达量最高，在背最长肌组织中表达量最低，且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的（P<0.01）。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达，其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体，并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁，在感染牛骨骼肌细胞后，能显著提高FoxO1表达水平（P<0.01）。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率（P<0.01），流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数，抑制细胞G1/S期的转化，并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现，增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调（P<0.01），促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调（P<0.05）。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少，qPCR检测结果发现，骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调（P<0.05）。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达，是一个广泛存在的转录调控因子，并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异，起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用，特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达，从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化，并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。

【背景】肌肉系统是维持动物体生存生长的重要基础，在哺乳动物肌肉中，将近一半的肌肉为骨骼肌，骨骼肌通过细胞繁育增殖到迁移融合，逐步形成了具有收缩能力的附着在骨骼上的成熟肌束。在机体内，骨骼肌不仅参与动物生长，也参与呼吸、代谢等生理活动。目前许多研究表明，lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用，是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子。但由于lncRNA作用机制复杂，方式多样，在物种间保守型很低，故不同种属动物lncRNA之间作用关系不大，且大多数研究存在于人和小鼠等生物体内，而对牛肌肉生长影响的研究内容极少。近年来，人们发现lncRNA会与某些靶基因相互作用，进而调控肌肉细胞的发生过程。【目的】在前期采集不同月龄不同组织部位的牛肌肉，进行高通量测序，获得高表达差异的lncRNA，在对其调控成肌过程进行机制研究的基础上，探究长链非编码RNA lnc721与其靶基因MMP9的互作关系，以及MMP9对牛骨骼肌细胞生长发育的影响，以期为牛骨骼肌发育调控机制的研究提供参考。【方法】前期试验发现干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有正调控作用，且对其分化具有负调控作用。为了进一步探究lnc721对牛肌肉发育的调控通路。分别在牛骨骼肌卫星细胞的分化期设置了3个干扰lnc721牛骨骼肌卫星细胞组，与3个对照组采用NGS技术进行转录组测序，以期获得lnc721差异靶基因，进一步研究lnc721对牛骨骼肌发育的调控通路。根据筛选结果以及qRT-PCR的验证结果，试验选取MMP9作为lnc721的靶基因，并通过CatRAPID网站对lnc721与MMP9结合能力进行预测。设计并合成lnc721及MMP9干扰序列，转染至牛骨骼肌卫星细胞中，通过qRT-PCR、Western blot技术在mRNA水平与蛋白质水平分析下调lnc721对MMP9表达情况的影响。并且通过下调MMP9，采用qRT-PCR、Western blot与EdU技术检测增殖标志因子Ki67、Pax7以及分化标志因子MyHC与MyOG的表达情况，以反映下调MMP9对牛骨骼肌卫星细胞生长发育的影响。【结果】CatRAPID结果显示，lnc721与MMP9结合倾向为0.75，共有9个结合位点，二者存在互作结合。干扰lnc721之后，采用qRT-PCR分析，结果表明在细胞增殖期下调lnc721可以极显著抑制MMP9表达（P<0.01），而在分化期则极显著促进MMP9的表达（P<0.01），证实了MMP9为lnc721调控牛骨骼肌卫星细胞互作的靶基因。进而下调MMP9，检测对增殖期细胞的影响，发现Ki67的mRNA水平表达极显著上调（P<0.01）,Pax7蛋白表达量显著上调（P<0.05）,EdU观察下调MMP9后的阳性细胞率也明显升高。同样检测下调MMP9之后对细胞分化期的影响，发现下调MMP9后镜下观察发现下调MMP9会抑制肌管形成，同时MyHC的mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01), MyoG蛋白表达量显著下调(P<0.05)。【结论】lnc721与MMP9相互结合。在细胞增殖期干扰lnc721极显著抑制MMP9表达，而在分化期促进MMP9的表达，且干扰MMP9可促进细胞增殖并抑制分化。证明lnc721靶向MMP9调控牛骨骼肌卫星细胞的发育。

【目的】探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体(pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a)或LncRNA-133a抑制物(si-LncRNA 133a)转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中(D0-D3),肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时(D2)表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期(D0):与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加(P<0.01),而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少(P<0.01),且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低(P<0.01),同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。

探讨宰后鸭肉骨骼肌细胞中是否发生细胞凋亡以及哪些因素对其产生影响,为进一步用细胞凋亡机理阐明水禽类肉的成熟机理提供新的试验依据。分析检测宰后鸭胸肉和腿肉中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达量和线粒体细胞色素-C含量变化、TUNEL法检测阳性凋亡细胞核数量变化以及宰后ATP代谢和pH值变化情况。结果显示,宰后鸭肉骨骼肌中Bax/Bcl-2蛋白表达量比值均显著上调(P<0.05),线粒体细胞色素-C含量均显著降低(P<0.05);ATP含量和pH值在宰后0.5...

为探究干扰叉头转录因子O1(Forkhead box protein O1, FOXO1)对牛前体脂肪细胞增殖和分化的作用，本研究以固原黄牛的前体脂肪细胞为研究对象，采用组织块法分离牛前体脂肪细胞，并利用表型鉴定和标志基因表达谱2种方法鉴定所分离细胞的纯度和分化潜能。筛选并包装牛FOXO1干扰慢病毒，利用EdU染色、流式细胞术、油红O染色和qPCR方法探究干扰FOXO1对牛脂肪细胞增殖和分化的作用。结果表明：1）成功分离了牛前体脂肪细胞，且其具有较高的纯度和分化潜能。2)EdU染色结果表示，侵染Lv-FOXO1极显著增加了牛脂肪细胞的增殖率（P<0.01）。3）流式周期结果显示，干扰FOXO1显著增加了牛脂肪细胞S期阳性细胞的比例，促进了G1/S期的转化，进而促进了牛脂肪细胞增殖。4）干扰FOXO1后，增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达量均极显著上调（P<0.01）。5）干扰FOXO1后牛前体脂肪细胞脂滴生成明显减少，且成脂标志基因PPARG的表达极显著下调（P<0.01）,CEBPB和LPL的表达显著下调（P<0.05）。综上，干扰FOXO1可通过上调增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达促进牛脂肪细胞G1/S期的转化，进而促进牛脂肪细胞增殖，且其可通过降低成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达减少牛脂肪细胞脂滴形成，进而影响脂肪沉积。本研究可为中国地方黄牛的肉质遗传改良提供理论依据。

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1—3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。待细胞汇合至70%—80%时,将培养基换成含50 nmol·L-1渥曼青...

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上，而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关，研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限，而共同处理的效果更为显著，虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道，但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制，为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞，并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞，在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后，利用CCK-8检测细胞活力；为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制，通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体，并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞，采用qRT-PCR和Western blot实验技术研究过表达MTNR1A、MTNR1B是否影响MLT对增殖基因的促进作用；为了进一步探究MLT与NMN对鹅骨骼肌卫星细胞增殖相关基因的影响，采用qRT-PCR和Western blot实验技术检测骨骼肌细胞增殖相关基因的表达变化。【结果】骨骼肌卫星细胞的特异性标志蛋白Pax7和Desmin分别在细胞核和细胞质中呈绿色荧光的阳性反应，结果表明试验所用细胞为骨骼肌卫星细胞，CCK-8检测结果表示1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN促进鹅骨骼肌卫星细胞活性，qRT-PCR和Western blot结果显示，与对照组相比，过表达MLT受体基因MTNR1A、MTNR1B后，增殖标志基因Pax7的mRNA和蛋白表达显著上调（P<0.05），抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05），抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05），其变化比NMN和MLT单独处理更为显著。【结论】MLT通过其受体促进骨骼肌卫星细胞增殖，NMN和MLT共同处理可以加强MLT对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的促进作用，也为MLT和NMN在家禽实际生产中的应用提供了新思路。

以高邮鸭和金定鸭为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定生肌调节因子MyoD1和Myf5基因在不同发育阶段鸭胚(13、15、17、19、21和23胚龄)骨骼肌成肌细胞中的表达水平,分析MyoD1和Myf5基因在鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达模式和差异.结果表明,Myf5和MyoD1基因在胸腿肌成肌细胞中呈现不同的表达规律:胸肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈"低→高→低→较高"的趋势,类似反"∽"形;MyoD1基因的表达呈"低→高→低"的趋势,在金定鸭17胚龄时达到高峰后迅速下降(P0.05)...

【目的】卵泡抑素（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积，可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞，阐明ｔＧＦ－β／ｓｍａｄ信号通路在Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化１４ ｄ的鸭胚为试验材料，采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞，待细胞长到７０％—８０％时，将培养基换成含有浓度分别为０、１、１０、１００ ｎＧ·ｍ ｌ－１的Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ培养基，继续培养３６ ｈ后，采用ＣＣＫ－８检测骨骼肌卫星细胞增殖情况；使用抗ｐａｘ７抗体染色，ｄａｐｉ染核，鉴定骨骼肌卫星细胞；采用ｒｅａｌ－ｔ．．．

【目的】卵泡抑素(Follistatin)能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%—80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·m L-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-t...

【目的】旨在证明miR-222可促进家兔骨骼肌卫星细胞增殖。【方法】利用实时荧光定量(RT-qPCR)法检测miR-222在初生新西兰兔各组织中的表达量;利用targetscan、miRbase等生物信息学软件预测miR-222的靶基因;对靶基因进行KEGG通路分析和GO分析,进而预测miR-222是否参与调控骨骼肌卫星细胞增殖;体外培养的骨骼肌卫星细胞转染miR-222过表达和抑制表达载体,利用CCK-8实验和EdU染色实验检测72、96和120 h细胞的增殖情况。【结果】miR-222在各组织中差异表达,且在肝脏中的表达量最高,回肠中的表达量最低;预测得到的靶基因富集到MAPK、PI3K-AKT等多个参与骨骼肌卫星细胞增殖的重要信号通路; CCK-8实验和EdU染色鉴定发现,过表达miR-222能促进骨骼肌卫星细胞增殖,miR-222抑制表达抑制骨骼肌卫星增殖。【结论】miR-222能够促进家兔骨骼肌卫星细胞的增殖。

［目的］研究支链氨基酸（ＢＣＡＡ）对大鼠骨骼肌细胞蛋白质代谢的影响，探讨氨基酸转运载体在ＢＣＡＡ调控细胞蛋白质代谢途径中的作用机制。［方法］用缺失支链氨基酸（Ｌｅｕ－，ＩＬｅ－，ＶＡＬ－）的无血清高糖型ＤＭｅＭ培养液培养Ｌ６肌管细胞，先后在培养基质中添加１００ ｎＭｏＬ·Ｌ－１雷帕霉素、支链氨基酸（Ｌｅｕ＋，ＩＬｅ＋，ＶＡＬ＋）和胎牛胰岛素，ＲＴ－ＰＣＲ法检测细胞表面氨基酸转运载体ＬＡＴ１、ＣＤ９８和ＳｎＡＴ２以及氨基酸调控因子ＧＣｎ２和ＡＴＦ４ ＭＲｎＡ表达，并结合ＷｅＳＴｅＲｎ－ＢＬｏＴ法考察蛋白合成关键因子磷酸化Ｓ６Ｋ１蛋白表达量及蛋白降解关键因子ＭｕＲＦ１和ＭＡＦＢｘ ＭＲｎＡ表达水平．．．

【目的】以茶碱为参照,观察中药成分牛蒡子苷对原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)活性及蛋白质合成的影响,探讨中药通过抑制PDE促进肌肉生长的作用及机理。【方法】分离1～3日龄ICR小鼠四肢肌肉用于骨骼肌原代细胞培养,在培养至第5～6天时向培养基中添加不同浓度的牛蒡子苷和茶碱,以不含牛蒡子苷和茶碱的培养基为阴性对照,继续培养24h,采用HPLC、ELISA以及考马斯亮蓝法分别测定骨骼肌细胞cAMP PDE的活性、细胞内cAMP水平以及细胞总蛋白质合成。【结果】牛蒡子苷终浓度达到2.5μg·ml-1、茶碱终浓度为20μg·ml-1时均能极显著抑制原代培养骨骼肌细胞...

旨在基于转录组筛选肉牛骨骼肌差异基因,探究差异基因对骨骼肌转录调控的影响,鉴定其与肌肉生长发育的关系,为研究骨骼肌生长发育的分子机制提供理论依据。采取12月龄的布莱凯特黑牛和鲁西黄牛背最长肌,利用Illumina 2500进行转录组测序,通过综合生物信息学分析(差异基因筛选、GO分类、KEGG富集分析和蛋白互作网络等)筛选骨骼肌差异的调控基因。布莱凯特黑牛和鲁西黄牛2个文库分别存在13 242,13 350个基因,共计13 758个基因。5 500个基因表达量相同,约占总参考基因的39. 98%,8 258个基因表达量有所不同,占比60. 02%。获得554个差异显著的基因作为差异表达基因,其中296个基因表达上调,258个基因表达下调。GO功能注释结果显示,生物学过程、细胞组分和分子功能分别包括22 641,7 720和4 414个基因,其中29个基因与肌细胞的发育和分化有关; KEGG富集到Wnt、CMC、TGF-β、DCM、ROAC、VSMC 6条肌肉生长发育相关通路,筛选骨骼肌候选基因MYL2、MYL3和MYLPF。MYL2、MYL3和MYLPF是Wnt、DMC和TGF-β信号通路中的成员,参与了肌细胞和肌肉组织的形成的过程,推测MYL2、MYL3和MYLPF在骨骼肌生长发育过程中发挥重要作用。

研究不同浓度的表皮生长因子对牛输卵管上皮细胞生长、增殖和凋亡的影响,目的是建立高质量的牛体外胚胎共培养细胞系。牛输卵管上皮细胞体外培养技术结合血球计数法检测细胞增殖,并利用流式细胞仪进行细胞周期和凋亡的检测,通过Lysis软件对数据进行分析。结果表明,EGF在0～50 ng/mL浓度范围内,其促增殖、抑制凋亡作用随浓度的增加而增大,呈剂量依赖性;当浓度持续增高时,其促增殖、抑制凋亡能力降低;此外,S期细胞数量明显增加,G2-M期细胞数量有下降趋势。表皮生长因子在一定浓度范围内具有促进牛输卵管上皮细胞增殖和抑制其凋亡的作用,并使其细胞周期发生变化。