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[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 刘小凡  谢晓磊  吴咏梅  陆应林  虞德兵  
[目的]本试验旨在研究c-Myc在鸡卵泡上的表达及FSH对c-Myc的诱导作用,为明确c-Myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层,检测c-Myc mRNA和蛋白的表达;应用FSH(50 ng/mL)处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度,检测颗粒层和膜层c-Myc、标记基因和周期相关基因表达;体外培养小黄卵泡颗粒细胞,敲减c-Myc 24 h后加入FSH(50 ng/mL)处理24 h,检测c-Myc 表达。[结果] c-Myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达量都显著高于排卵前卵泡,卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比,FSH增加了小黄卵泡颗粒层厚度约25.5%(P<0.05),密度约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上,FSH降低了c-Myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)mRNA的表达水平(P<0.05),提高了细胞增殖抗原(PCNA)和周期蛋白D2(CCND2)mRNA的表达水平(P<0.05)。[结论]FSH能诱导c-Myc在鸡颗粒细胞中的表达,且猜测c-Myc与体外培养的鸡小黄卵泡颗粒细胞的终端分化有关。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 于昊  李曼曼  薛洋  姜志洋  茆达干  
[目的]本试验旨在研究毛喉素(FSK)对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及其机制。[方法]体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞,预培养24 h。应用FSK(10 nmol·L~(-1))处理细胞48 h,检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达;处理96 h检测孕酮(P_(4))水平及类固醇合成相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,FSK改变了细胞形态,增大了细胞直径,并使细胞内脂滴含量增加(P < 0.01);FSK降低了细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA的表达水平(P < 0.01);FSK降低了颗粒细胞标记基因促卵泡素受体(FSHR)mRNA的表达水平,提高了黄体细胞标记基因前列腺素受体(PTGFR)和促黄体素受体(LHCGR)mRNA的表达水平(P < 0.01);FSK促进了P_(4)分泌,提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平(P < 0.01);从细胞周期看,FSK降低了细胞周期素B1(CCNB1)、细胞周期素D1(CCND1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)基因的表达(P < 0.01),而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B(P21~(cip1)/P27~(kip1))基因表达上调(P < 0.01),并将细胞周期阻滞在G0/G1期。[结论]FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢、退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 郭泽媛  杜张胜  张雅琦  陈春路  马晓燕  成颖  王锴  吕丽华  
【目的】卵泡发育是一个复杂的调控过程,其中绵羊卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs)的增殖,分化会直接影响卵泡的发育状况。TGF-β信号通路在绵羊卵巢发育和卵泡生长过程中起着重要作用,Smad7作为TGF-β信号通路关键性的抑制基因也发挥重要作用,通过探究Smad7介导TGF-β信号通路对绵羊卵泡GCs增殖凋亡的影响,为进一步研究Smad7在卵泡GCs增殖凋亡过程中的调控作用提供依据。【方法】选取4—6月龄未怀孕的晋中健康杜湖杂交母羊20只,屠宰后采集双侧卵巢组织,分离培养卵泡颗粒细胞,FSHR细胞免疫荧光鉴定,Smad7细胞免疫荧光的表达定位,CCK8法测定细胞增殖情况,绘制生长曲线;细胞传代后外源添加不同浓度Smad7激动剂积雪草苷(asiaticoside,AS)(0、100、200、400、600 ng·mL-1)培养绵羊卵泡GCs,选择AS最佳作用浓度处理二代颗粒细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平;合成3个siSmad7,转染至卵泡GCs中,选择干扰效果最佳的,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平。【结果】Smad7在绵羊卵泡GCs中有表达;200 ng·mL-1 AS能极显著上调Smad7在GCs的表达(P <0.01),siSmad7-1对绵羊卵泡GCs的转染效果最佳(P<0.01);Smad7上调能显著增加TGF-β信号通路Smad4,TFDP-1和EP300的表达量(P<0.05),极显著增加TGF-β信号通路SP1的表达(P<0.01),显著增加凋亡相关基因Caspase8的表达量(P<0.05),极显著增加凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量(P<0.01),显著升高细胞周期相关基因P21和P27的表达量(P<0.05),极显著升高细胞周期相关基因CCND2的表达量(P<0.01),而CCND1的表达量显著降低(P<0.05),极显著降低TGF-β信号通路SP1的表达量(P<0.01),显著降低凋亡相关基因Caspase8的表达量(P<0.05),极显著降低凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量(P<0.01),极显著降低细胞周期相关基因P21,P27和CCND2的表达量(P<0.01),极显著升高CCND1的表达量(P<0.01)。【结论】Smad7介导TGF-β信号通路抑制绵羊卵泡GCs增殖和促进细胞凋亡。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 刘小凡  谢晓磊  吴咏梅  陆应林  虞德兵  
[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用,为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层,检测c-myc mRNA和蛋白的表达;应用50 ng·mL~(-1)FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度,检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达;体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞,预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后,加入50 ng·mL~(-1) FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡,卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比,FSH处理后,小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上,FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平(P<0.05),提高了细胞增殖抗原(pcna)和周期蛋白D2(ccnd2)mRNA的表达水平(P<0.05)。[结论]FSH能诱导c-myc在鸡颗粒细胞中的表达,推测c-myc与体外培养的鸡小黄卵泡颗粒细胞的终端分化有关。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 张金璧  姚望  潘增祥  刘红林  
【目的】研究FSH处理对猪卵巢颗粒细胞类固醇合成酶、垂体激素受体、凋亡相关等基因表达的影响及此过程中组蛋白H3修饰的变化情况。【方法】首先,采集猪卵巢组织并用注射器抽取方法收集卵泡颗粒细胞,用含血清体系体外培养颗粒细胞至贴壁,血清饥饿16h后用终浓度5IU·mL~(-1)的FSH处理24h,并收集细胞。其次,提取细胞m RNA,采用qRT-PCR方法检测类固醇合成酶(STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1)、垂体激素受体(FSHR和LHR)、凋亡相关基因(XIAP和Fas L)m RNA的表达变化,最后,相同处理后固定细胞,采用染色质免疫沉淀结合q PCR(Ch IP-q PCR)方法检测类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B上游转录调控区组蛋白H3修饰(H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac)状况。【结果】5IU·mL~(-1)的FSH处理引起类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B分别为2倍(P<0.01)、2.8倍(P<0.01)和3.6倍(P<0.01)、13.6倍(P<0.01)、19.7(P<0.01)倍和2.5倍(P<0.05)的显著上调;STAR基因调控区的H3K9ac在处理后有11.1倍的显著下降(P<0.05);CYP19A基因调控区的H3K4me3和H3K9ac分别有0.5倍的上调(P<0.01)和10.4倍(P<0.01)的下降,其余组蛋白修饰在处理前后没有显著变化。【结论】FSH处理24h对颗粒细胞类固醇合成酶基因转录有显著上调作用,对其转录过程有H3组蛋白修饰参与,组蛋白修饰模式具有基因特异性。垂体激素受体和凋亡相关基因的应答可能需要FSH和其他因素的联合作用。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 杨方晓  李莲  赵若含  王根林  
[目的]本文旨在探讨HT-2毒素对牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响,并评估褪黑素(Mel)是否能减弱HT-2毒素对颗粒细胞的毒性作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞,使用0、5、25、50、75和100 nmol·L~(-1) HT-2毒素分别处理细胞24 h,或使用褪黑素(100μmol·L~(-1))预处理12 h后再用HT-2毒素(50 nmol·L~(-1))处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖,用细胞免疫荧光技术检测细胞自噬,用RT-qPCR分析内质网应激与自噬关键基因CHOP、GRP78、Atg7和p62 mRNA表达,用Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,HT-2毒素可导致卵巢颗粒细胞的增殖并呈浓度依赖性减少。免疫荧光染色显示HT-2毒素诱导的细胞自噬呈浓度依赖性增加(P<0.01)。褪黑素预处理显著减轻了HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬。[结论]HT-2毒素可诱导牛卵巢颗粒细胞的内质网应激和自噬并呈浓度依赖性增加,褪黑素可以缓解HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬作用。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 李烈川  申明  宁彩波  管志强  蒋毅  吴望军  刘红林  
[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,cck8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·l~(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响;Western-blot检测微管相关蛋白1轻链3(lc3,包括lc3-Ⅰ和lc3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/sQstm1的表达量变化,转染gFP-lc3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-mA)提前4 h抑制自噬后再氧化应激12 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,cck8检测细胞活力。[结果]氧化应激...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 王思琪   周春雪   李玉琦   杜星   潘增祥   李齐发  
【目的】探索miR-34a诱导GCs凋亡的RNA激活机制,为揭示猪卵泡闭锁的分子机理、筛选调控母猪繁殖的小核酸调节物提供依据。【方法】利用生物信息学方法分析猪miR-34a特征及其与潜在靶基因lncRNA NORHA启动子的结合情况。利用核质分离技术分析猪GCs中miR-34a的亚细胞定位。qPCR检测miR-34a对猪GCs中NORHA、凋亡标志基因BCL-2和BAX表达的影响。利用荧光素酶活性分析验证miR-34a对NORHA启动子转录活性的靶向调控关系。利用染色质免疫沉淀(ChIP)检测miR-34a对猪GCs中NORHA启动子miRNA反应元件(MRE)处AGO2和组蛋白修饰因子富集情况。利用western blot和流式细胞术分析miR-34a通过NORHA对下游因子FOXO1的表达和细胞凋亡的调控作用。【结果】猪miR-34a为基因间miRNA,其序列在哺乳动物中具有高度保守性。亚细胞定位分析显示,miR-34a在猪GCs中细胞核与细胞质均有分布。生物信息学分析显示miR-34a的MRE位于NORHA启动子-194 nt至-173 nt处,且两者结合自由能为-23.9 kcal·mol~(-1)。qPCR结果表明miR-34a显著上调猪GCs中NORHA的表达。荧光素酶活性分析显示,miR-34a极显著上调NORHA启动子报告载体活性,而对MRE突变型启动子活性没有显著影响。ChIP试验显示,miR-34a可增加NORHA启动子MRE处RNA诱导转录激活(RITA)复合物核心成员AGO2和转录激活型组蛋白H3K4me3的富集,而减少转录抑制型组蛋白H3K9me3的富集。共转试验显示,敲减NORHA可显著或极显著逆转由miR-34a过表达引起的FOXO1蛋白水平和早期凋亡率的上调,以及BCL-2/BAX比值的下调。【结论】细胞核miR-34a是猪GCs中的内源性小激活RNA(saRNA),通过靶向激活促凋亡lncRNA NORHA的转录,诱导猪GCs早期凋亡(细胞膜完整),可能参与猪卵泡闭锁的启动。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 雷忻  张育辉  
用免疫细胞化学方法,对隆肛蛙与北方山溪鲵不同发育时期卵泡c- myc和c- fos的表达产物进行了定位检测。结果表明,Myc在2种动物 - 期卵母细胞和滤泡细胞中表达较强,以后逐渐减弱;Fos在2种动物卵泡发育初期表达很弱,在 - 期卵泡中表达增强。上述结果说明,c- myc在2种动物卵母细胞发育初期起重要作用,而c- fos在发育中后期起重要的调控作用,2种原癌基因可能通过调节类固醇激素的合成与分泌来调控卵母细胞的发育。
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 王秋实  汪琴  韦伟  张鑫宝  夏梦圆  张立凡  陈杰  
【研究目的】本实验旨在研究酰基辅酶A合成酶家族成员2(ACSF2)基因启动子区突变c.-751 A>C与扬州鹅产蛋性能的相关性,并分析该突变位点对基因表达的调控作用。【方法】本研究利用等位基因特异PCR(AS-PCR)在343个扬州鹅个体中对c.-751 A>C位点进行基因型分析,并与产蛋性能关联分析;利用荧光定量PCR(qPCR)和荧光素酶表达载体检测AA型和CC型启动子活性差异;通过ACSF2过表达实验分析该基因对颗粒细胞能量代谢途径及鹅产蛋性能的影响。【结果】AA基因型个体产蛋性能显著优于CC基因型个体(P<0.05),与AC基因型个体的产蛋性能没有显著差异;qPCR结果表明AA基因型个体卵巢组织中ACSF2基因mRNA表达量显著低于CC基因型个体(P<0.01);荧光素酶表达载体的转录活性检测结果同样表明AA型启动子活性显著低于CC型。在扬州鹅卵泡颗粒细胞中过表达ACSF2基因,参与能量代谢的基因表达发生显著变化,ATP浓度显著升高(PC变异能够改变该基因的表达水平,通过改变颗粒细胞能量代谢进而影响扬州鹅的产蛋量。该突变位点可作为扬州鹅产蛋性能选育的分子标记。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 常振宇  董海龙  张笑冰  吴庆侠  
[目的]探究不同用量纳米氧化铜(nano-CuO)对藏鸡生产性能及肝组织原癌基因(c-Myc)表达的影响。[方法]取14日龄藏鸡120羽,随机分为空白对照组和低、中、高不同剂量nano-CuO组,每组设置3个重复,空白对照组藏鸡饲喂基础日粮,nano-CuO低、中、高剂量组藏鸡分别饲喂添加5,50和100 mg/kg nano-CuO的基础日粮,试验为期14 d。试验开始和结束时分别称量试鸡初始体质量和终末体质量,试验期间统计采食量,测算每组试鸡的平均日增质量、平均日采食量和饲料转化率等生产性能指标。28日龄时采集试鸡肝脏、肾脏样品,检测其金属硫蛋白(metallothionein,MT)含量,用HE染色法检测肾脏的病理学变化,用免疫组化法检测肝组织c-Myc蛋白表达水平,用RT-PCR法测定肝组织c-Myc mRNA表达水平的变化。[结果]与对照组相比,添加5~50 mg/kg的nano-CuO能显著提高藏鸡的体质量和平均日增质量(P0.05),4组藏鸡的平均日采食量和饲料转化率无显著差异(P>0.05),随nano-CuO添加水平的增加,不同组织中的金属硫蛋白(MT)含量逐渐升高,且肾组织更容易受到nano-CuO添加水平的影响。5 mg/kg nano-CuO组试鸡肾小球结构清晰;50 mg/kg nano-CuO组肾小球毛细血管充血,周围可见少量血细胞;100 mg/kg nano-CuO组肾小球破裂、萎缩,肾小管可见上皮细胞脱落,淋巴细胞浸润。100 mg/kg nano-CuO组试鸡肝组织c-Myc蛋白表达水平高于5和50 mg/kg nano-CuO组,而其c-Myc mRNA表达水平较5和50 mg/kg nano-CuO组极显著升高(P
[期刊] 中国农业科学  [作者] 陈吉刚  陈维虎  周继勇  王金勇  齐静  郑肖娟  俞照正  孙红霞  
将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/HisB,实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约为18kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体,建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA,探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2(0.4ng)对ConA活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性,而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-...
[期刊] 水产学报  [作者] 沈海洋  卢志杰  秦真东  赵丽娟  李亚男  刘春  杨光  叶成凯  易敢峰  林蠡  
为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-C-Myc 基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)有285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。表达和纯化了GF-1-C-Myc 蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术(qRT-PCR) 与免疫印迹法(WB)检测了GF-1-C-Myc 基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和NNV的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc 基因的表达,并显著消耗GF-1 细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控神经坏死病毒的感染提供了参考。
[期刊] 中国水产科学  [作者] 史艳艳  卢洁  王艺磊  王淑红  
本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z,CTSZ)、延伸因子1-α(elongation factor 1-α,EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)、β肌动蛋白(β-actin)6个候选内参基因在17α,20β双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况,并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析。Bestkeeper软件分析表明EF-1α的变异系数和标准差是6个候选内参基因中最低的,且Bestk...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 杨晓岚  张敏红  冯京海  翟利利  姜礼文  
【目的】研究高温诱导蛋鸡氧化损伤及对卵泡发育的影响,探讨环境高温抑制蛋鸡卵泡发育、降低产蛋量的机制。【方法】试验分两部分进行:试验一,将180只27周龄的海兰褐蛋鸡随机分为3个处理组,分别饲养于人工环境控制舱内,3个处理组分别为常温组(23℃,饲喂基础日粮)、日循环高温组(28—35—28℃,饲喂基础日粮)和高温补充VE组(28—35—28℃,饲喂基础日粮+250 IU·kg-1 VE),试验期14 d;试验二,分离蛋鸡F1和F2卵泡颗粒层并制备颗粒细胞悬浮液,将颗粒细胞分别在39或44℃下培养。【结果】试验一结果显示,日循环高温显著抑制蛋鸡卵泡发育,表现为产蛋数量下降(P<0.05)、卵巢重...
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